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植物学的研究已进入后基因组时代。基因组测序计划鉴定出大量的有待明确其功能的基因。一项研究蛋白质互作作图的重要技术是酵母双杂系统。这项技术的应用,需要一系列酵母菌及大肠杆菌转化,而后在营养缺陷型培养基上筛选阳性克隆。该技术1989年问世,在短短的10余年时间内,已成了研究蛋白质互作的重要手段,并揭示了生命体内大量的蛋白质互作关系。 拟南芥基因AtCHIP是一个与动物(人类、老鼠)基因CHIP有相似结构、功能和非常高的碱基同源性的植物基因,被证明是E3结合蛋白酶,参与泛素-蛋白酶体系的蛋白质降解作用。AtCHIP表现出与植物逆境胁迫如高温、低温、高盐的应答有关。为进一步探索AtCHIP的功能及其机理。本文以AtCHIP为研究对象,利用酵母双杂系统,从拟南芥cDNA文库中筛选与之有相互作用的蛋白质,从而进一步研究了其互作基因的功能。研究得到了以下主要结果。 1.利用酵母双杂技术,筛选得到了1036个与AtCHIP有互作的候选克隆,经营养缺陷型培养基筛选,共获得了111个阳性克隆,对质粒DNA进行了测序,测序结果提交拟南芥genebank分析,有29种蛋白与AtCHIP有相互作用(同源性达98%以上),有12种基因序列未在genebank中找到同源序列,可能为新的拟南芥基因。AtCHIP互作蛋白中重复频率最高的有UBC家属酶蛋白,Htransporting ATP synthesizing chain 9,叶绿体蛋白酶等。 2.证实了AtCHIP与缀合酶E2及泛素分子有专一性的互作关系。在已经被证实的40种拟南芥缀合酶E2中,UBC8、UBC9和UBC10 3种与AtCHIP有互作关系;同样,在已发现的15种泛素分子中,UBQ1、UBQ5二种与AtCHIP有互作关系。证明AtCHIP的这种互作关系是一种特导性的反应。 3.生物体外试验证实叶绿体蛋白酶Clpe4,FtSH1是以AtCHIP为E3的泛素-蛋白酶体系的底物。首先,利用PET系统,成功地表达了AtCHIP,UBC8,ClpP4等3个基因的蛋白质,并加以提纯。以此为材料进行了泛素化体外反应试验,以AtCHIP为E3,UBC8为E2,ClpP4为底物的体外反应试验结果表明,至少有3个泛素分子被结合到ClpP4分子上。 4.生物体内分子生物学检测(Western Blot)也证实ClpP4,FtSH1是AtCHIP