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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前世界上产量最大的微生物杀虫制剂。其主要特点是:杀虫效果好,对人畜及其它生物无害,无环境污染。然而,其活性成分芽孢和晶体对阳光中的紫外线非常敏感,致使其野外环境施用时药效持效期短。解决苏云金芽孢杆菌杀虫剂在环境中的持效性问题,目前主要采用改进剂型、UV突变育种、添加紫外防护剂和“生物囊”包被四种方法。本文通过研究一株野生型黑色素高产菌株Bt799的黑色素基因,构建了抗紫外苏云金芽孢杆菌基因工程菌,此外,还研制出一种Bt微胶囊实验室制剂,使其具有了抗紫外和缓释功能,进一步提高了苏云金芽孢杆菌的持效期。
本论文第二章首先对实验室保藏的野生型黑色素高产菌株Bt799进行菌种鉴定,初步鉴定为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus,Bc)。根据蜡状芽孢杆菌Bc ATCC10987酪氨酸酶基因序列来设计引物,通过PCR技术从Bt799菌株中扩增得到酪氨酸酶基因的DNA片段。将该片段克隆到克隆载体pMD18-T和表达载体pET-28(a)并分别转入大肠杆菌(Escherchia coli) DH5α及BL21中,后者所得到的转化子在添加了L-酪氨酸的LB培养基中能合成可溶性的黑色素。证明了目的基因编码酪氨酸酶,从而导致黑色素的形成。在此基础上,完成了蜡状芽孢杆菌Bt799的mel基因在苏云金杆菌cry3A启动子调控下在Bacillus thuringiensis subsp. israelensis(Bti)中的表达。结果表明,重组菌株Bt TD799在酪素平板上能产生大量黑色素。同时还证明,重组菌株同野生型Bt799一样,在非诱导条件下可在普通的LB培养基上产生大量黑色素。SDS-PAGE和native-PAGE结果显示重组菌株可以高水平表达产生分子量约30kD的酪氨酸酶。为了构建杀虫抗紫外的苏云金杆菌工程菌株,将构建好的含有cry1Ac基因的重组质粒pHAc42转入产黑的Bt TD799中,双抗筛选得到同时产Cry1Ac晶体和黑色素的转化子,SDS-PAGE结果显示130kD的Cry1A晶体蛋白得以表达,光镜和透射电镜下观察,转化菌株能产生菱形伴胞晶体。经紫外照射2h后生物测定结果显示,转化子的杀虫活性没有显著变化,照射4h后,其杀虫活性仍然保持了85%。以上结果表明重组菌的抗紫外能力得以增强。
本论文第三章通过改进型来增强Bt的抗紫外能力,成功的研制出一种基于海藻酸钠的新型苏云金芽孢杆菌微胶囊实验室制剂并已申请专利,微胶囊粒经分布范围均匀,芽孢及晶体载药量4.45×1011 CFU/g,包封率可达86.8%.生测结果表明,包囊菌的LC50值为4×10-5μl/ml,LC90为6×10-5μl/ml,略高于游离菌的LC50值(3×10-5μl/ml)及LC90值(8×10-5μl/ml)说明包埋对Bt效价影响不大,且SA对Bt没有毒害作用。缓释试验证明三个月累积释放85.84%。经紫外照射(波长254nm高度25 cm)2 h后对目标昆虫进行生物测定表明,采用改进方法制备的苏云金芽孢杆菌标准株Bt.israelensis和Bt.kurstaki HD-1微胶囊悬浮剂,其LC50值分别比未微胶囊化的降低了88.2%和81.2%,表明了海藻酸钠对细菌本身及试虫均无毒害作用,且具有较好的紫外保护作用,同时微胶囊的这种物理屏障对紫外线的抵抗作用大致相同。