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Prohibitin作为一种高度保守的蛋白广泛分布于细菌、原虫、酵母等多种生物细胞中,主要定位于细胞膜、线粒体内膜、细胞核中,参与细胞增殖、分化、衰老、凋亡等多种生物学进程。由于其结构进化上的保守性,功能的多样性,正逐渐引起广泛的关注。
本实验对日本七鳃鳗(Lampetra iaponica)血液白细胞cDNA文库中2123条有效EST序列进行分析,拼接获得一条650bp核酸序列,以日本七鳃鳗外周血白细胞RNA为模板进行PCR扩增。通过cDNA3’末端快速扩增反应、CDS区的克隆最终获得全长为828bp的目的基因。
对克隆获得的目的基因进行同源搜索,搜索的结果显示我们克隆所得为Prohibitin家族中Prohibitin1基因。采用生物信息学的方法和工具对日本七鳃鳗中Prohibitin1蛋白相应的氨基酸序列的理化性质、结构特征、功能及系统演化关系等进行预测和分析,以期为该基因的进一步研究提供一定的理论依据。
将目的基因Prohibitinl与表达载体pET-32a酶切后连接。构建原核表达载体pET-32a-PHB,将其转化至宿主菌BL21中,并通过IPTG诱导使其表达。并用小鼠单克隆抗体进行免疫印迹分析对表达所得蛋白加以鉴定。
半定量的方法研究Prohibitin1在日本七鳃鳗各个组织中的特异性表达情况,并通过其在不同组织中的表达差异,推断Prohibitin蛋白是非分泌型蛋白,并有可能参与了类B淋巴细胞介导的信号通路。为进一步证实Prohibitin1与日本七鳃鳗中可能存在的免疫调节的关系,运用RT-PCR的方法检测不同组织中PHA刺激前后Prohibitin1表达量的变化。结果表明PHA刺激后白细胞、心、鳃中Prohibitin1含量有较大幅度上调。这以结果也间接的证明了在七鳃鳗这种古老的脊椎动物中存在有类B淋巴细胞调节的可能。