论文部分内容阅读
目的：前期,我们实验室已经确证了建立一定的共培养条件可以诱导间充质干细胞转分化为汗腺样细胞。但其中关键的基础科学问题并没有完全解决,本研究的主要目的是,利用microRNA新技术,寻找MSCs分化为汗腺样细胞过程中的关键microRNA及其介导的信号通路调控,并验证microRNA细胞生物功能。方法：前期研究表明,EDA-A1能促进正常和外胚层发育缺陷小鼠的汗腺、毛囊等外胚层组织器官的发育,EGF能提高MSCs分化为SGLCs的诱导率。因此,本文采用1μg/ml EDA-A1、50 ng/ml EGF以及汗腺热休克损伤微环境,通过transwell间接培养板,诱导MSCs分化为SGLCs。然后通过microRNA基因芯片检测,分析MSCs诱导前后,以及正常汗腺的microRNA差异表达谱,其中发生极其显著改变的microRNAs被筛选出来,通过生物信息学进行靶点预测,其中直接靶向与汗腺发育、干细胞分化相关基因的microRNAs:has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p被进一步筛选出来。利用脂质体2000转染试剂分别将synthetic has-miR-138-5p mimics (inhibitor)-cy3、synthetic has-miR-146a-5p mimics (inhibitor)-cy3和synthetic microRNA mimics (inhibitor) negative control-cy3转染MSCs,进行靶基因验证,分析其参与的信号通路网络,并进一步验证其生物功能。结果：通过间接诱导模型,诱导10d后,transwell培养板上层的MSCs,部分形态由“长梭形”变为“不规则椭圆形或多边形”,局部呈现“铺路石”样结构。进行免疫荧光检测,结果显示大部分诱导后的细胞CEA、CK19、CK7、CK8和CK14表达阳性,说明部分细胞经诱导后表型转换为汗腺样细胞。MicroRNA表达谱的差异比对结果显示,SGLCs VS MSCs,19 microRNAs上调,49 microRNAs下调;SGCs VS MSCs,120 microRNAs上调,59 microRNAs下调。为了缩小研究范围,我们取SGLCs VS MSCs和SGCs VS MSCs的交集,结果37 microRNAs在以上两个比对中均出现,其中12 microRNAs上调,25 microRNAs下调。通过生物信息学靶点预测,我们发现该37个microRNAs：与汗腺发育和干细包分化的一系列因子相关,例如靶向细胞因子CEA、KRT、EDA以及参与信号通路EDA/EDAR、NF-κB、Wnt、ERK等的调节。其中has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p.均直接靶向NE-κB信号通路相关的多个基因。MicroRNAs转染MSCs 48 h后,荧光显微镜下观察,大部分细胞胞浆显示饱和的红色荧光,流式结果亦显示转染效率为98.56%. RT-PCR结果显示,has-miR-138-5p抑制剂转染MSCs 48 h后,h-KRT19、h-NFKB1、h-RELA和h-RELB的表达显著增高,但转染前后均不表达h-KRT16, has-miR-138-5p模拟物转染MSCs后,h-NFKB1、h-RELA和h-RELB表达显著降低。另,has-miR-146a-5p抑制剂转染MSCs后,h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表达增高,has-miR-146a-5p模拟物转染MSCs后,h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表达降低。报道显示,miR-146是NF-kB通路的负反馈调节者,表达miR-146a的细胞,其IκBα的丝氨酸32位置的磷酸化将降低至～40%。因此,我们推断,MSCs诱导过程中,has-miR-138-5p减少,导致其调节的靶基因h-NFKB1、h-RELA、h-RELB表达增加,从而激活NF-κB信号通路,这时,作为一个负反馈调节机制,has-miR-146a-5p表达增加,导致h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表达降低,从而从上游调节和抑制NF-κB的活化。结论：在MSCs诱导分化成SGLCs过程中,has-miR-138-5p下调激活NF-κB通路,has-miR-146a-5p上调,负反馈抑制NF-κB活化,两者形成NF-κB正负反馈调节环路。MicroRNAs介导的NF-κB信号通路调节是诱导MSCs分化成SGLCs的关键分子机制之一。