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研究背景： 系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus, SLE）是一种典型的慢性自身免疫性疾病，发病人群主要为女性，以进行性累及肾脏、关节、心脏、脑等多个器官的慢性炎症以及过度产生的各种自身抗体为特征。目前临床常用的治疗药物包括免疫抑制剂及抗炎药等，但因尚无有效的选择性阻断自身免疫性炎症形成的手段以及不同程度的药物毒副反应，导致 SLE 的治疗效果始终不尽如人意。尽管一些生物制剂如肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factorα, TNF-α）单抗在选择性治疗关节相关的自身免疫性疾病如类风湿性关节炎中已取得一定的疗效，但其对SLE的靶点治疗效果却令人失望。因此，了解炎症调节的本质以及参与其中的复杂的信号通路是找到SLE潜在治疗靶点的关键。 SLE的发病机制十分复杂，发病过程中存在各种自身免疫表型异常，如免疫耐受缺陷、T、B 细胞功能失调、凋亡细胞清除障碍等。研究发现，SLE 疾病过程中炎症信号调控失衡导致了SLE的发病，如Toll样受体/白介素-1受体（Toll like receptor / interleukin 1 receptor, TLR/IL-1R）信号通路中，下游分子核因子κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）被激活，造成广泛的 TLR 应答基因的诱导，引起促炎细胞因子的释放，进而导致 SLE的发病。因此，参与启动炎症信号级联的上游中心分子将可能成为SLE的一个潜在的治疗靶点。 全基因组关联分析研究（genome-wide association study, GWAS）发现，IRAK1与SLE的易感性有关，并被GWAS确认为SLE的易感基因，但以IRAK1生物学功能为基础，引起SLE发病的确切机制仍不清楚。研究发现，IRAK1缺陷的狼疮倾向小鼠中SLE相关症状消失，包括高水平的血清免疫球蛋白M（immunoglobulin M, IgM）和免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG）自身抗体、淋巴细胞和树突状细胞的异常活化以及肾脏损伤等。这些研究提示IRAK1是SLE发病的一个重要因素。 IRAK家族是唯一一个死亡结构域包含激酶的家族，在固有免疫系统中发挥着重要的作用。白介素1受体相关激酶1（interleukin-1 receptor-associated kinases 1, IRAK1）于1996年被首次发现，其由14个外显子组成，人类IRAK1基因位于X染色体q28区，在组织器官中广泛表达，其相对分子质量约为 76kD，蛋白全长包含 712 个氨基酸。作为一个丝/苏氨酸蛋白激酶，IRAK1是IRAK家族发现的第一个成员，并且是TLR/IL-1R信号通路中的一个关键分子。细胞质内的TIR（TLR/IL-1R）结构域是启动所有TLR和IL-1R信号转导的关键。TLRs和IL-1R的外结构域通过与它们的同源配体结合，引起可溶的TIR结构域相关接头蛋白髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88, MyD88）在其胞浆区募集。MyD88 可以促进接下来的 IRAK1 和白介素 1 受体相关激酶 4 （interleukin-1 receptor-associated kinases 4, IRAK4）对受体复合物的募集，IRAK1被IRAK4激活，并在Thr209处发生磷酸化。接下来IRAK1发生自身磷酸化，并与肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor associated factor 6, TRAF6）发生相互作用，形成IRAK1-TRAF6复合物，促进NF-κB的激活及其核转位。NF-κB的活化导致促炎细胞因子如白介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、白介素6（interleukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα, TNF-α）的过度产生以及促炎基因的转录并最终导致SLE的发病。这一促炎信号级联对SLE的发病至关重要，因此，抑制IRAK1的功能可能对减小促炎信号级联介导的组织损伤有一定的价值。 鉴于IRAK1在SLE免疫调节及炎症形成和发展中的重要作用，我们希望探讨其在SLE 发生发展中的生物学效用，抑制其活性能否对 SLE 炎症反应起到治疗作用。本研究拟从以下三个部分开展研究工作：第一部分为体内实验，通过 B6.MRL-Faslpr/Nju （B6.lpr）狼疮倾向小鼠模型，研究 IRAK1 在 SLE 炎症发生中的作用，以及 IRAK1/4抑制剂（IRAK1/4 inhibitor, IRAK-Inh）在改善B6.lpr狼疮倾向小鼠肾脏损伤以及缓解炎症反应中的作用。具体实验为：小鼠腹腔注射IRAK1抑制剂2.5mg/kg，每周3次，共注射2周；Western blot检测IRAK1、pIRAK1、NF-κB抑制蛋白（inhibitor of nuclear factor kappa B, IκB）α、pIκBα、NF-κBp65、pNF-κBp65蛋白表达量；HE染色法检测小鼠肾脏损伤情况；免疫组织化学法检测小鼠肾脏组织中免疫复合物IgG和补体C3（complement C3）沉积情况以及小鼠脾脏单核细胞中NF-κBp65的核转位情况；酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测小鼠血浆中IL-6、IL-1β水平。第二部分为体外实验，利用SLE患者外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）体外研究IRAK1及其抑制剂IRAK-Inh在SLE发病和治疗中的作用。PBMCs体外进行10μM IRAK-Inh刺激24h，Western blot检测刺激前后IRAK1、pIRAK1、IκBα、pIκBα、NF-κBp65、pNF-κBp65蛋白表达量；免疫组织化学法检测PBMCs中NF-κBp65的核转位情况。第三部分通过IRAK1小干扰核糖核酸（small interfering ribonucleic acid, siRNA）对SLE患者PBMCs中的IRAK1基因进行沉默，Western blot检测IRAK1 siRNA感染或IRAK-Inh刺激PBMCs后IRAK1、pIRAK1、IκBα、pIκBα、NF-κBp65、pNF-κBp65蛋白表达量，以观察IRAK-Inh对IRAK1及NF-κB信号通路的抑制效果。通过本研究，期望能明确IRAK1在SLE炎症形成中的作用，为SLE的发病机制及治疗方法提供新的理论依据。 研究一 IRAK1在B6.lpr狼疮鼠脾脏单核细胞中的活性以及IRAK1-Inh对狼疮鼠肾脏损伤的治疗作用 目的： 探讨B6.lpr狼疮鼠脾脏单核细胞中IRAK1、IκBα和NF-κBp65的表达及磷酸化水平；腹腔注射IRAK-Inh对IRAK1活性、NF-κB信号通路的抑制作用及其对狼疮鼠肾脏损伤的治疗作用，为IRAK1在SLE发病中的重要性以及IRAK-Inh在鼠类狼疮中抗炎治疗的作用提供新的理论依据。 方法： 1. IRAK-Inh腹腔注射：雌性12周龄B6.lpr狼疮鼠及正常对照C57BL/6小鼠各随机分为两组，每组3只，分别注射IRAK-Inh 2.5mg/kg（溶解于100μl二甲基亚砜（dithiothreitol, DMSO）中）或者安慰剂DMSO 100μl，3次/周，连续注射2周； 2. IRAK1及IRAK-Inh在狼疮鼠脾脏单核细胞中的生物学作用：蛋白质印迹法检测IRAK1、pIRAK1、IκBα、pIκBα、NF-κBp56、pNF-κBp65蛋白表达量；组织病理检测小鼠肾脏损伤情况；免疫组织化学法检测小鼠肾脏IgG和C3沉积情况；免疫细胞化学法检测小鼠脾脏单核细胞中 NF-κBp65 核转位情况；ELISA 检测小鼠血清中 IL-6、IL-1β水平；采用GraphPad Prism（Version 5.0）统计软件进行组间非参数Mann-Whitney U检验或方差分析（Analysis of Variance, ANOVA）检验，P＜0.05认为有显著性差异。 结果： 1. IRAK1在B6.lpr狼疮鼠脾脏单核细胞总蛋白中的表达及磷酸化水平 B6.lpr+DMSO 组狼疮鼠脾脏单核细胞中 IRAK1 及其磷酸化水平均高于正常C57BL/6组小鼠（P＜0.01）；腹腔注射IRAK-Inh 2周后，B6.lpr+IRAK1-Inh组狼疮鼠脾脏单核细胞中IRAK1的表达及其磷酸化水平虽较正常C57BL/6组小鼠仍高，但较注射安慰剂B6.lpr+DMSO组狼疮鼠明显下降（P＜0.01）。 2. 腹腔注射IRAK-Inh治疗后B6.lpr狼疮鼠肾脏损伤情况 (1)未接受IRAK-Inh腹腔注射的B6.lpr狼疮鼠（B6.lpr+DMSO组）肾脏表现为典型的狼疮肾炎特征，且肾小球疾病活动程度评分（glomerular activity score, GAS）和肾小管疾病活动程度评分（tubulointerstitial activity score, TIAS）均高于正常C57BL/6组小鼠（分别 P＜0.01 和 P＜0.05 ）；而接受 2 周 IRAK-Inh 腹腔注射治疗的狼疮鼠（B6.lpr+IRAK1-Inh组）肾脏损伤情况得到了明显改善，GAS和TIAS评分虽仍比正常C57BL/6小鼠高，但明显低于未治疗B6.lpr+DMSO组狼疮鼠（均P＜0.05）； (2) 免疫荧光结果发现B6.lpr+DMSO组狼疮鼠肾小球中免疫复合物IgG和C3的荧光强度均明显高于正常 C57BL/6 小鼠以及腹腔注射 IRAK-Inh 治疗两周的B6.lpr+IRAK1-Inh组狼疮鼠。 3. IRAK-Inh腹腔注射治疗对NF-κB信号通路的抑制作用 (1) 未注射 IRAK-Inh 治疗的 B6.lpr+DMSO 组狼疮鼠脾脏单核细胞中 NF-κBp65 （P＜0.05）、p IκBα（P＜0.01）及p NF-κBp65（P＜0.01）蛋白表达量均高于正常C57BL/6组小鼠，IκBα表达量虽较正常C57BL/6+DMSO组小鼠稍增高，但无统计学差异；腹腔注射IRAK-Inh 2周后，B6.lpr+IRAK1-Inh组狼疮鼠脾脏单核细胞中NF-κBp65（P＜0.05）、p IκBα（P＜0.01）及p NF-κBp65（P＜0.01）蛋白表达量与注射安慰剂B6.lpr+DMSO组狼疮鼠相比均明显下降（均P＜0.01）； (2) 免疫细胞化学检测发现B6.lpr+DMSO组狼疮鼠脾脏单核细胞中NF-κBp65的表达几乎全部转移至核内，而经过两周IRAK-Inh腹腔注射治疗的B6.lpr+IRAK1-Inh组狼疮鼠与正常C57BL/6小鼠相似，NF-κBp65的表达大多聚集在核外； (3) ELISA法检测小鼠外周血血浆中IL-6和IL-1β含量结果 结论： IRAK1在B6.lpr狼疮鼠脾脏单核细胞中异常活化，导致NF-κB通路被激活；IRAK-Inh能够逆转IRAK1及NF-κB的异常活化并对狼疮鼠肾脏损伤起到一定的治疗作用。 研究二 IRAK1在SLE患者PBMCs中的表达以及IRAK1-Inh对NF-κB通路的抑制作用 目的： 探讨SLE患者PBMCs中IRAK1、IκBα和NF-κBp65的表达水平及磷酸化差异；IRAK-Inh体外刺激对PBMCs中IRAK1活性、NF-κB信号通路的抑制作用。通过体外实验模拟人类SLE发病的生物学过程，并对IRAK1成为SLE治疗靶点的可能性提供新的理论依据。 方法： 1. IRAK-Inh体外刺激：分离SLE患者及正常人PBMCs后，各加入10μM IRAK-Inh或0.4μl DMSO，细胞培养箱中刺激24小时； 2. SLE患者PBMCs中IRAK1及IRAK-Inh对NF-κB炎症信号通路的作用：Western blot检测PBMCs中IRAK1、pIRAK1、IκBα、pIκBα、NF-κBp65、pNF-κBp65蛋白表达量；免疫细胞化学法检测PBMCs中NF-κBp65核转位情况；采用GraphPad Prism（Version 5.0）统计软件进行组间非参数Mann-Whitney U检验或ANOVA检验，P＜0.05认为有显著性差异。 结果： 1. IRAK1在SLE患者PBMCs总蛋白中的表达 SLE+DMSO患者组PMBCs中IRAK1及pIRAK1表达均高于正常对照组（normal control, NC）（NC+DMSO和NC+Inh组），（均P＜0.01）；IRAK-Inh体外刺激24h后， SLE+IRAK1-Inh患者组PBMCs中IRAK1的表达及其磷酸化水平较SLE+DMSO组明显下降（均P＜0.01）。 2. 体外IRAK-Inh刺激24h对NF-κB信号通路的抑制作用 (1) SLE+DMSO组PBMCs中pIκBα及pNF-κBp65蛋白表达量均明显高于NC组， （均P＜0.01），NF-κBp65蛋白表达量虽较正常NC+DMSO组稍增高，但无统计学差异；体外IRAK-Inh刺激24h后，SLE+IRAK1-Inh组PBMCs中pIκBα及pNF-κBp65蛋白表达量与SLE+DMSO组相比均明显下降（均P＜0.01）； (2) 免疫细胞化学检测发现，无论是否加入IRAK-Inh刺激，NC组（NC+DMSO和NC+IRAK1-Inh组）PBMCs中NF-κBp65的表达均大多聚集在核外，核内仅有少许表达；未加入IRAK-Inh刺激的SLE+DMSO组PBMCs中，NF-κBp65的表达几乎全部转移至核内，而加入IRAK-Inh体外刺激24h后，SLE+IRAK1-Inh组PBMCs中NF-κBp65表达大多聚集在了核外。 结论： IRAK1 在 SLE 患者 PBMCs 中表达异常增高，且 NF-κB 通路活性也明显增强；IRAK-Inh体外刺激能够降低IRAK1及NF-κB信号通路的活性，说明IRAK1可能通过抑制炎症信号通路的活性成为SLE的一个潜在的治疗靶点。 研究三 IRAK1干扰载体对IRAK1-Inh抗炎治疗作用的鉴定 目的： 利用IRAK1腺病毒干扰载体对SLE患者PBMCs中的IRAK1基因进行沉默，比较其与IRAK-Inh对IRAK1的抑制作用。通过体外实验对IRAK-Inh抗炎治疗效果进行鉴定，为IRAK-Inh治疗SLE的潜力提供新的理论依据。 方法： 1. IRAK1干扰载体感染SLE患者PBMCs，或对PBMCs进行IRAK-Inh体外刺激：按MOI=50计算腺病毒加入量，将2.5μl空载病毒Ad-GFP以及2μl干扰腺病毒Ad-IRAK1 shRNA3分别加入至2孔SLE患者PBMCs中感染2h，换液后继续培养36h；同时在另2孔细胞中加入0.4μl DMSO或10μM IRAK-Inh，体外培养24h；每孔均做2个复孔。 2. SLE患者PBMCs中IRAK1及NF-κB信号通路相关蛋白的表达：Western blot检测PBMCs中IRAK1、pIRAK1、IκBα、pIκBα、NF-κBp65、pNF-κBp65蛋白表达量；采用GraphPad Prism（Version 5.0）统计软件进行组间非参数Mann-Whitney U检验或ANOVA检验，P＜0.05认为有显著性差异。 结果： IRAK-Inh 刺激组（ SLE+IRAK1-Inh 组）以及 IRAK1 干扰腺病毒感染组（SLE+Ad-IRAK1 shRNA3组）PBMCs中IRAK1、pIRAK1、pIκB、pNF-κBp65表达分别与无 IRAK-Inh 刺激组（SLE+DMSO 组）以及空载腺病毒感染组（SLE+Ad-control组）相比均明显降低，且有统计学差异（P＜0.01）；但SLE+IRAK1-Inh组与SLE+Ad-IRAK1 shRNA3组相比，上述蛋白表达无差异（P＞0.05）。 结论： IRAK-Inh与IRAK1干扰腺病毒载体相似，能有效抑制SLE患者PBMCs中IRAK1及NF-κB通路相关蛋白的活性，说明IRAK-Inh对SLE患者PBMCs中NF-κB的异常活化有较好的抑制作用，为SLE治疗药物的研究提供新的思路。