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抗坏血酸(L-Ascorbic acid,AsA)作为人类必需的一种维生素之一,对于人类的健康,发挥着不可替代的作用。普通小麦是人类最重要的粮食作物之一。尽管小麦籽粒中AsA的含量很低,在加工食用的过程中也会有一定的损失。但是研究小麦中的AsA合成机制,尝试提高小麦中的AsA含量,对于提高面粉的加工品质,增强小麦的抗逆性和增强小麦的营养价值等方面,具有一定的现实意义。
GDP-甘露糖焦磷酸化酶(GDP-Mannose Pyrophosphorylase,GMPase)是植物体内AsA合成途径中的关键酶之一。拟南芥中该基因突变体(vtc1)的研究,给我们展示了其在AsA的生物合成、抗氧化、抗逆、铵离子耐受性和糖基化等方面都有非常重要的作用。本论文选择该基因作为研究对象,是系统的在小麦中研究AsA合成机制,寻找提高小麦中AsA含量的努力之一。
本论文采用同源克隆的方法,从普通小麦小偃54中克隆到6个GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因,分别定位于第三同源群(TaGMP1)和第四同源群(TaGMP2)的不同染色体上。获得了第三同源群上GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(TaGMP1)的基因组DNA和编码区DNA全长。获得了第四同源群上GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因(TaGMP2)的基因组DNA和部分剪切变异产生的cDNA全长。测序结果表明,TaGMP2中存在剪接变异体,而TaGMP1中则不存在这种现象。
调查了部分已测序植物中的GDP-甘露糖焦磷酸化酶基因的拷贝数、收集了这些物种中GDP-甘露糖焦磷酸化酶的氨基酸序列,进行了进化分析。对TaGMP基因在小麦及其近缘种中的单元型变异情况进行了扫描,发现其非常保守,没有明显的多态性。对TaGMP2剪切变异的方式进行了初步的分析,通过和TaGMP1的比较,对TaGMP2存在大量剪切变异的因为及可能的生物学意义进行了初步的探讨。通过全长保守引物的片段分析对不同组织器官中TaGMP2的剪切变异情况进行了初步分析,没有发现基因全长的剪切变异体的存在。这暗示TaGMP2可能在进化的过程中丧失了功能。
利用定量PCR对TaGMP1和TaGMP2类别,以及TaGMP1的各个成员进行了表达分析。结果发现,TaGMP1类别在各个组织器官中总的表达均高于TaGMP2,在幼叶和旗叶中这种差别最为明显。TaGMP1的各基因成员之间的表达水平没有明显差异,推测各个基因成员之间的功能可能存在累加效应。.
酵母互补实验证明TaGMP1基因的三个成员都有功能,能够互补酵母中的vig9突变体菌株H17-6C的功能。但从转入相应基因的酵母的生长情况来看,发现TaGMP1基因的三个成员之间功能上存在差异,TaGMP1-B1的功能最强,TaGMP1-D1的功能次之,TaGMP1-A1的功能最弱,这种推测有待通过TaGMP基因的突变体进一步研究。
BSMV介导的基因沉默实验表明发生基因沉默的小麦叶片中TaGMP1类群基因能够被特异的沉默,其表达量只有对照的30％左右。发生基因沉默的小麦叶片的AsA含量有一定的下降,大约是对照的80％左右。这意味着TaGMP1参与了小麦AsA的生物合成,但可能不是小麦AsA合成中的关键限速酶。
首次在普通小麦中建立了特定基因缺失突变体的高效筛选方法TILDING(1argeting induced local deletions in genomes),可以作为TILLING技术的补充,应用到小麦基因的功能研究和实际的育种实践中。利用小麦高分子量麦谷蛋白基因座位Glu-1,估计了在以小偃81干种子作为离子束诱变的材料,离子束注射的能量为E=30 KeY,注射剂量为8×1017 N+/cm2和10×1017 N+/cm2的情况下,离子束诱变群体可造成小至0.2 cM范围以内,大至13.3 cM以上大小的染色体片段的缺失。
利用TILDING方法对离子束诱变的小偃8l群体中对TaGMP缺失突变体进行了筛选,获得了TaGMP基因所有6个成员的缺失突变体。除了TaGMP-B1,其它5个成员都获得了两个或两个以上的独立突变体家系。对于这些突变体,进行了AsA含量的初步测定。此外,对这些突变体进行了回交和两两杂交,目前已经回交一代,杂交一代。从后代里筛选到了分离出来的回交一代纯合突变体和获得了TaGMP2和TaGMP2类群内的双重突变体的纯合突变体植株。这些材料将为下一步深入进行功能研究奠定基础。
通过本论文的研究,表明在小麦中GMPase参与了AsA的生物合成,但不是关键限速酶。进化分析发现GMPase植物中非常保守,氨基酸序列一致性在80％以上。在小麦族内的片段分析结果TaGMP基因非常保守,几乎没有多态性存在。酵母互补实验表明TaGMP1基因的三个成员都有功能,但存在强弱的分化(TaGMP1-B1>TaGMP1-D1>TaGMP1-A1)。这使得我们有可能借用这一体系,寻找到活性最强的GMP基因,通过转基因的方式创造新的种质资源。
通过本论文的研究,首次建立了从离子束诱变群体中用长度特异性的保守引物和片段分析相结合高效筛选缺失突变体的方法TILDING,此前还未见文献中有报道。多个基因突变的筛选,充分证明了这种方法的有效性和广阔的应用前景。