论文部分内容阅读
以巴西茄为试材,研究了不同外植体类型和激素种类及浓度对其不定芽诱导和分化的影响,建立了巴西茄高频再生体系。同时,对影响根癌农杆菌介导巴西茄遗传转化效率的条件进行了深入探索,建立了遗传转化体系;在此基础上,进行了ipt基因的转化,并获得了经PCR进行检测证实的转基因巴西茄植株。主要研究结果如下:
1.巴西茄再生体系的建立种子消毒的最佳方法为:15%NaCl0浸泡15min;最佳条件:25±1℃下暗培养7d;诱导不定芽分化的最佳外植体为下胚轴上部;最适宜的分化培养基为MS+1 mg/L IAA+4.0 mg/L 6-BA;生根最佳培养基为MS+0.5mg/L NAA;对其不定芽进行组织学观察结果表明,分化出的不定芽具有顶端分生组织、叶原基和幼叶等典型的芽的结构特征。
2.巴西茄遗传转化体系的建立以下胚轴作为转化受体,通过对选择压、抑菌浓度、预培养、共培养时间、菌液浓度、感染时间以及是否进行延迟筛选等因素进行研究,确定转化体系的最佳实验参数。实验结果表明:卡那霉素在转化、筛选和抗性芽生根时适宜浓度分别为600mg/l和300mg/l;最适羧苄青霉素浓度为250mg/l;预培养2d,共培养4d为最适培养时间;OD值=0.7,将外植体浸泡20min时转化频率最高;相比不进行延迟筛选时,延迟筛选的拟转化率高。
3.转化植株的分子检测对抗性植株进行分子检测,以未转化的植株为阴性对照,以质粒DNA为阳性对照,以卡那抗性基因、ipt基因以及链霉素抗性基因的特异性引物进行PCR检测。结果表明,转基因植株扩增的条带和质粒扩增的条带一致,而未转基因的植株没有扩增出基因条带。从而证实,外源ipt基因已经整合到巴西茄植株的基因组中。