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日本血吸虫病(Schistosomiasis japonicium)是一种严重危害人、畜健康,影响社会和经济发展的人、畜共患寄生虫病。近年来我国血吸虫病防治工作取得了一定的成绩,但在两湖地区血吸虫病流行仍较严重。由于钉螺孳生环境没有改变,灭螺效果难以持久和巩固,并可能造成生态环境污染;长期使用吡喹酮进行扩大化疗,有产生耐药性的危险。作为灭螺、药物防治和其他综合防治措施的重要补充,血吸虫病疫苗的研究就显得十分必要。迄今研制的一些日本血吸虫亚单位基因工程疫苗保护效果还不够理想,多价多表位疫苗是探索提高疫苗保护效果的有效途径之一。本论文应用基因工程技术研制了日本血吸虫表膜蛋白二价多表位重组抗原疫苗,通过小鼠日本血吸虫病免疫保护试验评估疫苗所诱导的免疫保护效果,以期找出具有较好保护力的抗日本血吸虫病疫苗。应用荧光实时定量PCR分析Sj23和Sj-Tsp2基因在血吸虫童虫和成虫的表达情况,并利用生物信息学技术分析其抗原性和亲水性等特性,PCR扩增Sj23(EC1)、Sj23(EC2)、Sj-Tsp2(EC2)具有较高抗原性多表位的DNA片段,构建pET32a(+)-Sj23(EC1-EC2)和pET32a(+)-Sj-Tsp2(EC2)-Sj23(EC2)原核表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)并用IPTG诱导表达融合蛋白,His柱亲和层析法纯化重组蛋白。蛋白印迹法(western blotting)分析该重组蛋白的免疫原性。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠4次后,各组小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴40±2条,感染6周后,经肝门静脉灌注法收集成虫和检测每克肝脏虫卵数,计算减虫率和肝脏减卵率。各组小鼠分别于免疫前、各次免疫后1周和剖杀时收集血清,ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平;荧光实时定量PCR技术分析目的基因在免疫后的转录变化水平。荧光实时定量PCR结果显示,Sj23和Sj-Tsp2基因在日本血吸虫各个时期都有转录,且在童虫期转录较高;免疫pET32a(+)-Sj-Tsp2(EC2)-Sj23(EC2)蛋白组收集的虫体为模板,与PBS空白组虫体的模板相比,Sj23和Sj-Tsp2基因在血吸虫转录都明显下降了,同时pET32a(+)-Sj23(EC1-EC2)组Sj23和Sj-Tsp2基因的转录也下降。构建的重组蛋白pET32a(+)-Sj23(EC1-EC2)和pET32a(+)-Sj-Tsp2(EC2)-Sj23(EC2)相对分子质量(Mr)分别为32.08kDa和37.5kDa。western blotting分析结果表明,该重组蛋白具有良好的抗原性。小鼠免疫保护试验结果显示: pET32a(+)-Sj23(EC2)组, pET32a(+)-Sj23(EC1-EC2)组和pET32a(+)-Sj-Tsp2(EC2)-Sj23(EC2)组分别获得27.66%,33.47%和41.66%减虫率和35.87%,55.31%和41.16%肝脏减卵率,与空白组相比都有显著差异(P<0.05)。间接ELISA试验结果表明,用重组蛋白免疫后小鼠血清特异性抗体都显著升高。本文在分析Sj23和Sj-Tsp2表达时相和生物信息学分析其特性的基础上,成功构建了2个日本血吸虫表膜蛋白的二价多表位疫苗,在大肠杆菌中成功表达并纯化得到具有较高抗原性的重组蛋白,在实验动物中诱导了显著的免疫保护效果,免疫机制研究表明疫苗的保护作用可能和其免疫诱导的高水平的抗体和转录下降有关。本文为抗日本血吸虫病多价多表位疫苗的研制成功探索了方法,结果证明具有潜在的应用价值。