论文部分内容阅读
目的：构建含抗转铁蛋白受体单链抗体(TfR-scFv)和阴性寡肽尾D4S×5融合蛋白基因的重组原核表达载体pTfRscFv-D4S×5,转化至大肠杆菌BL21表达,鉴定融合蛋白的生物学活性,为scFv-D4S×5融合蛋白携带治疗基因靶向杀伤肿瘤细胞的研究奠定基础。 方法：以pEGFP-N1-TfRscFv载体为模版,设计两条引物引入酶切位点NdeⅠ和EcoRⅠ以及3′端的连接肽Gly4Ser,采用聚合酶链式反应PCR进行扩增,获得TfRscFv-Linker基因。将获得的单链抗体基因克隆至pGEM-T载体上,转化大肠杆菌DH5α进行蓝白筛选,挑取阳性克隆扩增。双酶切鉴定并测序证实后,将TfRscFv-Linker亚克隆至pET-28a上,获得pTfRscFv-linker。设计合成两条互补的阴性寡肽尾D4S×5基因序列,两端引入EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点,将两条互补单链退火形成寡核苷酸双链,重组入pTfRscFv-linker,获得重组载体pTfRscFv-D4S×5,转化大肠杆菌DH5α,双酶切并测序鉴定。pTfRscFv-D4S×5转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,纯化重组蛋白,通过SDS-PAGE、Western-Blot鉴定,并通过流式细胞术检测蛋白与高表达TfR肿瘤细胞的结合活性。 结果：测序表明通过PCR获得了正确的TfRscFv-Linker基因序列,亚克隆至pET-28a后,NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切可见约750bp的小片段和约5.3kb的大片段,与理论计算值相符,证明pTfRscFv-linker构建成功。pTfRscFv-D4S×5测序表明退火的D4S×5寡核苷酸双链成功克隆至pTfRscFv-Linker原核表达载体上,用NdeⅠ和NotⅠ双酶切可见约850bp的小片段和约5.3kb的大片段,理论计算值相符,且测序正确,表明TfRscFv-D4S×5原核表达载体构建成功;表达载体转化到大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达3h,经SDS-PAGE﹑Western-Blot验证,包涵体中出现约32.5kDa的目的条带。FCM检测结果表明抗TfRscFv-D4S×5融合蛋白能够与天然高表达TfR的细胞特异性结合,对照组细胞培养上清则未见与上述细胞有结合。 结论：成功构建抗TfRscFv-D4S×5融合蛋白的原核表达载体pTfRscFv-D4S×5,融合蛋白可在大肠杆菌BL21中以包涵体的形式表达,且具备与TfR阳性细胞特异性结合的能力。