【摘 要】
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柑橘黄龙病是世界柑橘生产中最具毁灭性的病害,目前对柑橘黄龙病的致病机理还不清楚。对治病机理的研究一般着眼于对治病基因或相关蛋白的功能分析上,分泌蛋白就是这样一类被
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柑橘黄龙病是世界柑橘生产中最具毁灭性的病害,目前对柑橘黄龙病的致病机理还不清楚。对治病机理的研究一般着眼于对治病基因或相关蛋白的功能分析上,分泌蛋白就是这样一类被人们所关注的分子。Ⅰ型分泌系统在细菌中行使蛋白主动运输功能,其运输机制被研究的较为清楚,通过其分泌进攻性的蛋白分子是细菌作用于寄主的一个主要途径。本研究根据GenBank上的全基因组序列,设计了引物,扩增到了柑橘黄龙病中的Ⅰ型分泌蛋白基因(COG2931),并构建了它的重组表达载体,在大肠杆菌中进行了表达,并对表达出的蛋白进行了分离和纯化。主要获得了一下结果：1.从长春花感病叶片中提取了黄龙病病原菌的基因组DNA,并用PCR方法和电子显微镜观察的方法进行了验证。利用提取的DNA成功扩增了柑橘黄龙病中的Serralysin基因,得到的片段长度为2089bp,经测序和比对,发现该基因确实属于Serralysin家族,并在其序列中发现了3个保守结构域,和3个串联重复的区域。2.我们对该基因设计了基于pET-22b(+)的重组表达载体,使其与组氨酸标签融合表达,再转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞内进行了诱导表达。对诱导表达的条件进行了筛选,得到的最适表达条件为将菌液在37℃下振荡培养到OD600~0.6,加入0.4mM的IPTG,然后在28℃下继续培养3.5小时。3.诱导表达得到的蛋白进行了分离和纯化,方法为硫酸沉淀和Ni柱亲和层析。最后得到的蛋白纯度为99%,蛋白的回收率为1%。
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