【摘 要】
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鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的一种主要发生于4周龄以下雏鸭的传播迅速、高度致死性的传染病。在我国爆发的鸭肝炎主要是由DHV-I引起,雏鸭一旦感染DHV死亡率为
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鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起的一种主要发生于4周龄以下雏鸭的传播迅速、高度致死性的传染病。在我国爆发的鸭肝炎主要是由DHV-I引起,雏鸭一旦感染DHV死亡率为100％。本实验对DHV-I的EFl4株VP1基因进行了RT-PCR扩增。建立了重组表达质粒,命名为pET30a-VP1。并制备了纯度较高的DHV-I抗原,以此免疫Balb/c小鼠并建立了间接ELISA筛选方法。经过一系列的融合筛选,成功研制了抗I型DHV单克隆抗体3株。本实验为实验室建立DHV快速诊断方法及今后对DHV-I的研究奠定了基础。
根据GenBank发表的DHV-I全基因组序列设计合成一对引物(含有BamHI和XhoI两个酶切位点),利用PCR技术扩增VP1基因,并克隆入pMD18-T载体,测序鉴定。将阳性VP1基因插入表达载体pET30a中,构建重组表达质粒pET30a-VP1,进行PCR和双酶切鉴定,并使其在大肠杆菌BL21中高效表达。融合蛋白为包涵体形式存在,经超声破碎后,利用SDS-PAGE电泳观察外源基因表达条带大小是否与预期相符。并对融合蛋白进行纯化。用纯化的蛋白作为抗原来免疫Balb/c小鼠后建立间接ELISA筛选方法。细胞融合前反复试验,确定了间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件,阳性血清和阴性血清分别作为阳性和阴性对照。取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,用间接ELISA方法筛选出3株阳性杂交瘤细胞株,将获得的阳性细胞株用有限稀释法进行3次亚克隆,分别命名为2D9、2D10和5F7。最后将扩大培养的杂交瘤细胞注入Balb/c小鼠腹腔,每只注射2×106个细胞使其产生腹水,制备单克隆抗体。对这3株单克隆抗体的稳定性、抗体亚类、腹水效价、特异性进行了鉴定,结果表明本实验所获得的单抗均具有良好的特异性。
本研究成功制备了3株能稳定分泌抗DHV-IVP1蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞株,试验表明已经掌握了体外细胞分离培养、抗原鉴定纯化以及细胞融合技术,这为制备更多的单抗、研制抗原检测试剂盒以及对Ⅰ型鸭肝炎病毒的进一步研究奠定了基础。
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