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肝纤维化是细胞外基质合成和降解不平衡的结果,是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径。大量实验室和临床研究认为,如果加以有效的治疗措施干预,肝纤维化进程可逆转,反之病情将会恶化,最终进展至肝硬化。临床准确评估肝纤维化程度及进展,与患者预后直接相关,并为临床制定该疾病的治疗方案提供有效的客观依据,所以早期诊断肝纤维化具有重要的临床意义。
可是由于肝纤维化的形态学改变不明显,以反映解剖结构为主的传统二维超声及反映血流速度等参数的彩色多普勒超声所提供的信息有限,尚不能准确诊断肝纤维化。
迄今为止,肝穿刺活检及病理检查仍然是临床诊断肝纤维化的金标准,然而它是一种创伤性检查,存在一定的并发症,患者常难以接受,因此限制了其在临床的广泛应用和普及。由于肝组织的纤维化情况在肝内分布不均,穿刺所取的肝组织仅占全肝的百万分之一,因此也不可避免地存在诊断性误差。而肝纤维化又是一个损伤和修复的过程,仅一次的肝穿刺活检不能有效监测整个肝纤维化的全过程。
目前探索一种既准确简便,又安全经济,易推广且适用于长期随访的无创性诊断和评估肝纤维化的手段以替代有创的穿刺活检技术已成为当前研究的热点和难点之一。
超声弹性成像是最近研发的一种超声新技术,它的基本原理是对组织施加一个内部(包括自身的)或外部的动态或者静态/准静态的激动。在弹性力学、生物力学等物理规律作用下,组织将产生一个响应,例如位移、应变、速度的分布发生一定的改变。根据压迫前后反射的回波信号获取各深度上的位移量,计算出变形程度,再以彩色编码成像,通过不同颜色图像反映被测体的硬度,能够获得组织内部的弹性分布的定量信息,由于生物组织的弹性(或硬度)与病变的生物学特性紧密相关,故对疾病的诊断具有重要的参考价值。
超声造影也是一种最新的技术,超声造影剂作为血液示踪剂可反映肝脏血液循环状态,其在肝内循环时间的变化又可间接提示肝内细微结构的改变。超声造影参数可以定量评估器官的微小的血流动力学改变。研究发现,肝纤维化和肝硬化时,不仅肝实质硬度发生改变,而且存在明显的肝内外血流动力学改变,这为超声弹性成像及超声造影评估肝纤维化提供了理论基础。
目前,国内外均没有联合超声弹性成像技术及超声造影来从不同的角度共同评价了肝纤维化的程度。因此,我们将建立大鼠肝纤维化模型,试图通过超声弹性成像技术及超声造影联合对肝纤维化程度进行定量分析并且作出诊断,一是从肝脏硬度的改变出发,二是从血流动力学变化出发来判断肝纤维化的程度,对照病理进行分析,寻找一种更加接近肝纤维化病理诊断的影像学辅助检查方法。
方法：
一、论文一
1、超声仪器：HITACHI公司的彩色超声仪HV900,线阵探头,频率为4-9 MHz。
2、研究对象：本研究由中国医科大学附属第一医院医学伦理委员会审查通过,并征得所有受试者的知情同意。选择2008.11-2009.3中国医科大学附属第一医院,消化门诊及病房就诊的非酒精性脂肪肝患者105例,其中男性56例,女性49例,平均年龄45±12岁。严格按照超声脂肪肝分度标准,分为轻度、中度、重度3组:其中轻度46例,中度39例,重度20例(由两名十年以上经验的医师操作并共同给脂肪肝患者分度)。设非肝脏疾病患者45例为对照组,其中男性23例,女性22例,平均年龄37±12岁。
3、超声弹性成像扫查方法：患者仰卧位,扫查部位选择第8或9肋间,调节适当的深度及增益。启动弹性成像功能,确定感兴趣区域的大小(感兴趣区域框的上下径2 cm,左右径不限)。感兴趣区域尽量避开大血管分支。压力指数应严格控制在2级或3级。
4、超声弹性成像评分标准：根据以下标准评分。弹性图像1分表现为绿色区域均匀分布,蓝色斑点少于感兴趣区域的10％,肝包膜呈蓝色;弹性图像2分表现为主要以绿色为主,蓝色斑点少于感兴趣区域的25％,包膜呈蓝色;弹性图像3分表现为蓝色斑点少于感兴趣区域的50％,包膜呈绿色;弹性图像4分表现为蓝色斑点大于感兴趣区域的50％,包膜呈红色(由两名六年以上经验的医师操作并共同给患者评分)。
5、自定义蓝色区域面积比值测量及计算方法：超声弹性成像技术的图像在感兴趣区域内可见蓝色的类圆形区域,采用二维图像面积测量法测量感兴趣区域内每个蓝色区域面积的总和,称为蓝色区域总面积。用以下公式算出蓝色区域面积比值:蓝色区域面积比值=感兴趣区域内蓝色区域总面积/感兴趣区域总面积。
6、统计学方法：采用SPSS13.0统计软件处理各组数据。计数资料采用Kappa值分析评价传统超声与超声弹性成像评分两种检查方法对脂肪肝分度的一致性。计量资料用均数±标准差表示,组间均数的比较采用t检验,以P＜0.01为差异有显著统计学意义。
二、论文二
1、实验动物及主要实验试剂：37只wistar大鼠,由中国医科大学动物实验中心提供,雌雄不限,体重约200g,饲养在层叠式不锈钢丝笼中,食用标准丸状饲料,自由饮用自来水。空气湿度为50-70％,温度为20-29℃,实验中心通风较好,噪音较小,适应环境1周后使用。设对照组10例,余27只以肝纤维化程度不同分为S1(11例)、S2(9例)、S3(7例)组。
SonoVue超声造影剂(Bracco Imaging,Milan,Italy)、四氯化碳、橄榄油、水合氯醛等。
2、超声仪器：IU22(Philips,Holland),配有线阵造影探头,频率为3-9 MHz;HITACHIHV900,小凸阵探头,频率为4-8 MHz。
3、肝纤维化制造方法：实验组大鼠背部皮下注射40％四氯化碳/橄榄油溶液,首剂量为0.5 mL/100 g体重,以后每次0.3 ml/100 g体重。1-6周注射2次/周(周一和周五注射),7-10周根据大鼠状态注射1次或2次/周(周一注射或周一和周五注射),共注射10周。
4、超声造影扫查及分析方法：大鼠麻醉后,仰卧位固定,充分暴露上腹部,备皮待查。按0.1 ml/kg剂量经尾静脉团注SonoVue造影剂,尾随1.5 ml生理盐水冲洗管道,实时观察肝脏增强过程120 s,采集的图像存入仪器硬盘。
使用Qlab软件对造影图像进行分析,血管结构的感兴趣区域应该尽量置于血管的中央,通过回放实时图像确定血管的位置并且限定感兴趣区域面积约等于血管截面积。电脑自动绘制时间.强度曲线(Time intensity curve:TIC),将曲线进行Gamma回归后,得到开始增强时间(Initial Enhancement Time:IET)、达峰时间(Time to peak:TTP)、峰值强度(Peak Intensity:PI)、曲线上升斜率、曲线下面积等相关指标。同时得到曲线上升初始时间(Initial enhancement time:IET),即肝动脉到达时间(Hepatic artery arrival time:HAAST)、肝静脉到达时间(Hepatic veinarrival time:HVAT),通过计算得到肝动静脉时间间隔(Hepatic artery-vein transittime:HA-HVTT)、门静脉峰值强度到肝实质峰值强度的时间间隔(PV-parenchymaPIT:PIT)等参数作为定量评估指标。每只大鼠每一参数分析三次取平均值。
计算方法:HA-HVTT=HVAT-HAAT。PIT=门静脉达峰时间-肝实质达峰时间。
5、超声弹性成像方法及评分标准：大鼠麻醉后,仰卧位固定,充分暴露上腹部,备皮待查。超声检查选择在肋下进行扫查,充分显示肝脏,调节适当的深度及增益。启动弹性成像功能,确定感兴趣区域的大小(感兴趣区域包含大部分肝脏组织)。
根据以下标准评分。弹性图像1分表现为绿色区域均匀分布,蓝色斑点少于感兴趣区域的10％,肝包膜呈蓝色；弹性图像2分表现为混杂绿色与蓝色,蓝色斑点少于感兴趣区域的25％,包膜仍是呈蓝色；弹性图像3分表现为蓝色斑点少于感兴趣区域的50％,包膜呈绿色；弹性图像4分表现为蓝色斑点大于感兴趣区域的50％,包膜呈红色(由两名六年以上经验的医师操作并共同评分)。
6、病理学方法：肝组织用10％常规石蜡包埋,连续切片,切片厚度为4μm,并依次行HE、Masson及网状纤维(镀银)染色。
应用Nikon90i高清晰度彩色病理图文报告分析系统,对经过Masson及网状纤维染色的切片进行图像处理,在4×20倍下分别在5个不同的视野选取相同大小区域,进行纤维化半定量计分(依据Chevallier肝纤维化组织学半定量计分系统)及测算其中胶原纤维所占总面积的相对百分比(由二名以上医师共同观察评定)。
根据Scheuer分类法可将肝纤维化分为四期:S1为汇管区扩大,纤维增生;S2为汇管区周围纤维化或纤维隔形成,但小叶结构保留完整;S3为肝纤维化伴小叶结构紊乱,无肝硬化:S4为肝硬化。
7、统计学方法：采用SPSS17.0统计软件处理各组数据,计量资料用均数士标准差表示,组间均数的比较采用t检验,计数资料采X2检验,变量间的相关关系进行pearson相关分析,以P＜0.05为差异有统计意义,以P＜0.01.为差异有显著统计意义。
结果：
一、论文一
1、Kappa分析法评价传统超声与超声弹性成像评分两种方法在脂肪肝分度上的一致性,Kappa值=0.87,P=0.001。
2、超声弹性成像评分随着脂肪肝程度的加重而增加,其对脂肪肝检出的敏感度和特异度分别为97.14％,91.11％。
3、BAR值随着脂肪肝程度的加重而增加,并且在各组脂肪肝之间比较有显著差异,P＜0.01。
二、论文二
1、HAAT值组间比较差异无统计学意义,P＞0.05,PIT值组间比较差异无统计学意义,P＞0.05。HVAT值随着肝纤维化的加重逐渐减小,组间比较差异有统计意义,P＜0.05,HA-HVTT值随着肝纤维化的加重逐渐减小,组间比较差异有显著统计意义,P＜0.01。
2、随纤维化分期的加重,纤维化半定量计分与胶原相对含量逐渐升高,与HA-HVTT呈负相关关系,相关系数分别为r1=-0.828,P=0.001、r2=-0.819,P=0.001。
3、HA-HVTT值诊断肝纤维化(S3)的敏感度与特异度分别为85.71％,66.67％。
4、超声弹性成像技术诊断肝纤维化(S3)的敏感度与特异度分别为71.43％,53.33％。
5、超声弹性成像联合超声造影诊断肝纤维化(S3)的敏感度与特异度分别为85.71％,73.33％。
6、超声弹性成像联合超声造影诊断肝纤维化的敏感度高于超声弹性成像诊断的敏感度,两者比较有统计意义,P＜0.01。超声弹性成像联合超声造影诊断肝纤维化的特异度均高于分别应用超声弹性成像及超声造影诊断肝纤维化的特异度,两者比较有统计意义,P＜0.01。
结论：
1、超声弹性成像评分系统可以作为较客观的评价脂肪肝分度的辅助检查方法。
2、超声弹性成像蓝色区域面积比值可作为定量分析脂肪肝的参考指标。
3、超声造影参数肝动静脉渡越时间将可以作为无创评价肝纤维化的定量观察指标。
4、超声造影及超声弹性成像技术联合应用提高了诊断的特异度,减低了误诊率。