论文部分内容阅读
流感病毒属正粘病毒科,每年导致全世界数十万人死亡。流感病毒分为A型、B型、C型三种,其中甲型流感病毒具有易变性,常与世界性大流行密切相连。接种疫苗可以预防和控制流感爆发,与传统疫苗和DNA疫苗相比,mRNA疫苗具有安全性高、免疫原性强、可以体外快速设计合成和大规模成产等优点。由于体内外存在大量RNA酶,且mRNA本身性质不稳定性,导致其容易降解,因此合适的递送技术不仅可以提高mRNA疫苗稳定性,而且有效增强疫苗引发的免疫应答反应。在本论文中,我们设计流感病毒H1N1-FM1株HA mRNA疫苗,通过合适的体外转录系统获得HA mRNA疫苗,并且设计和制备DEC205 scfv/tp融合蛋白,研究了 HA mRNA疫苗-融合蛋白复合物对小鼠免疫效果的影响。1、mRNA疫苗设计、构建与体外表达检测mRNA疫苗靶基因的设计参照H1N1-FM1株HA基因,送公司合成。将公司送回的菌液扩大培养,用XbaI和PmeI酶切从菌液提取的质粒,体外转录酶切产物获得HA mRNA 疫苗。HA mRNA 疫苗通过 Lipofectamine2000转染 293T 细胞,western blot 结果显示HA mRNA疫苗在细胞中成功表达。2、HA mRNA-DEC205 scfv/tp融合蛋白体内递送系统研究树突状细胞(dendritic cells,DCs)是体内最主要的抗原呈递细胞,具有启动机体免疫应答的能力。研究表明靶向DCs表面膜蛋白分子DEC205可以增强DCs对抗原摄入、加工和提呈能力。鱼精蛋白是一种正电荷碱性蛋白,可与带负电荷HA mRNA形成复合物,避免降解 mRNA。DEC205 单链抗体(single chain antibody fragment,scfv)融合蛋白可以与mRNA形成复合物,增加mRNA稳定性、靶细胞摄取能力。鱼精蛋白截短体(truncated protamine,tp)衍生于鱼精蛋白,具有大量碱性氨基酸序列,拥有与鱼精蛋白相同的结合核酸能力。根据这些特性,我们通过设计并合成DEC205 scfv/tp DNA片段,连接转入表达载体,转化大肠杆菌表达并提取DEC205 scfv/tp质粒,通过真核细胞表达体系表达和纯化获得蛋白。根据考马斯亮蓝染色法、western blot和液质联用色谱仪定量检测结果,纯化蛋白为DEC205 scfv/tp融合蛋白。在HA mRNA-融合蛋白复合物免疫效力试验中,将动物分为5组:空白组、对照组,鱼精蛋白-HA mRNA(质量比1:2)组,融合蛋白-HA mRNA(质量比1:1)组,融合蛋白-HA mRNA(质量比1:2)组。通过皮内注射,以每只10μg HA mRNA含量免疫小鼠,分别于0d、14d、28d免疫小鼠,第三次免疫14d后用致死剂量的H1N1-FM1株病毒感染小鼠。观察小鼠体重变化与存活率和评价HA mRNA的免疫效果。结果表明,融合蛋白-HA mRNA疫苗(1:1)组,具有60%存活率;融合蛋白-HA mRNA疫苗(1:2)组,存活率为40%,结果表明,融合蛋白介导HA mRNA疫苗递送具有一定的免疫保护作用,并随着融合蛋白剂量的增加相应增强。