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目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM),是一组以慢性血糖水平增高为特征的代谢疾病,主要病因是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能衰竭。长期慢性的血糖控制不良,以及随之而来的高血脂、高血压,可以导致心,眼,肾,足等多个脏器的并发症,严重影响人们的生活质量。有报导证实,胰岛素抵抗和β细胞功能衰竭很大程度上是由于有炎症因子和免疫反应的存在。大量研究支持2型糖尿病是一种慢性低度炎症状态的假说,临床的观察来看,很多糖尿病患者的体内有多种炎症因子浓度的升高,对2型糖尿病的发生发展有一定的预测性。动脉粥样硬化是糖尿病大血管病变的病理基础。英国的前瞻性研究表明,仅仅控制好血糖并不能有效的降低大血管并发症的发病率,这提示我们虽然血糖是造成糖尿病大血管病变的始动因素,但是不是唯一因素,在大血管病变发展的过程中,还有别的因素参与进来。现在认为,动脉壁炎症性疾病是造成动脉硬化的重要原因。血糖升高会导致内皮细胞功能不良,凋亡,内皮完整性及保护作用遭到破坏,屏障作用消失,黏附分子表达增加,趋化因子释放,白细胞黏附,巨噬细胞活化,平滑肌细胞迁移和增殖,最终形成动脉斑块。NF-κB作为核转录因子,参与了多种炎症反应,免疫反应。NF-κB可以激活多种免疫和炎症反应有关的基因包括白介素-1,6、干扰素、肿瘤坏死因子-a、血管细胞粘附分子-1和胞间粘附分子[1]。NF-κB也可通过调整自身克隆基因和IκB的表达水平以达到自身调节的目的[2]。有学者认为NF-κB是动脉粥样硬化发生的始动机理之一[3]。Linder等使用原位杂交和免疫组织技术研究发现,在小鼠内皮细胞受损伤后45分钟,在其受损的内皮细胞核中NF-κB p65和p50蛋白亚体含量明显较正常为高,3小时后经Northern杂交技术发现VCAM-1mRNA及蛋白的表达增高[4]。大量的实验研究涉及到NF-κB及其所诱导表达的细胞因子在方方面面的应用,本实验就是体外观察高糖对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡及产生核因子-kappaB(NF-κB)、细胞间粘附分子(ICAM-1)、白介素-6(IL-6)的影响,探讨炎症反应在糖尿病大血管病变发病机制中的作用,并应用硫辛酸干预,探讨该药的可能作用及机制。
方法:
体外培养HUVEC细胞,分为5组:(1)对照组(葡萄糖浓度:5.5mmol/L)(2)高糖组:(葡萄糖浓度:25mmol/L)(3)高糖+硫辛酸(50μmol/L)组(4)高糖+硫辛酸(100μmol/L)组(5)高糖+硫辛酸(200μmol/L)组,分别于0h,6h,12h,24h,48h留取样本进行检测。应用流式细胞术测细胞凋亡,Western Blot测NF-κB的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞培养上清液中的ICAM-1和IL-6的分泌情况。
结果:
1高糖组细胞凋亡及上清液中IL-6较对照组在6h、12h、24h、48h均显著升高(P＜0.01)。加入LA干预,48h后,A1组没有明显的变化(P＞0.05),而A2、A3组凋亡率及IL-6均较高糖组下降(P＜0.01),呈现药物剂量依赖性。
2高糖组细胞上清液中ICAM-1较对照组在12h、24h、48h显著增加(p＜0.01)。加入LA干预,48h后,A1组没有明显的变化(P＞0.05),而A2、A3组ICAM-1均较高糖组下降(P＜0.01),呈现药物剂量依赖性。
3高糖组细胞核NF-κB蛋白的表达量随着高糖作用时间的延长而明显增加,而在给予硫辛酸干预后NF-κB蛋白的表达逐渐下降。
结论:
1高糖环境可导致人脐静脉内皮细胞凋亡,NF-κB、ICAM-1、IL-6水平显著增加,提示炎症机制可能与糖尿病大血管病变的发生有关。
2 IL-6在高糖作用早期(6h)就以表现出升高,提示其可能早期就参与了糖尿病大血管病变。
3硫辛酸注射液能减少细胞凋亡,减轻NF-κB表达,抑制炎症因子ICAM-1、IL-6的表达,从而改善内皮细胞功能,减轻炎症损伤。提示硫辛酸可能通过NF-κB途径降低炎症反应,从而延缓高血糖对内皮细胞的毒性作用,提示其对糖尿病及其并发症有防治作用,早期硫辛酸应用可使糖尿病患者获益。