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本文主要从以下几方面展开论述：
第一部分 重组麻疹病毒沪191株（r-MV-Hu191株）对胃癌溶瘤作用及其机制研究。
研究目的:
胃癌是世界上最常见的癌症之一，死亡率很高。尽管癌症死亡率在下降，但五年的总生存率仍然很低。因此，寻找有效的治疗方法，提高胃癌患者的生存率已成为当务之急。之前，许多不同种类的溶瘤病毒已被用来研究作为新的癌症治疗手段。Hu191是一种麻疹减毒活疫苗株，作为一种安全的疫苗在中国使用已超过50年，有报道称麻疹病毒Hu191株对肺癌有溶瘤作用，但尚未在其他恶性肿瘤中报道。而且麻疹病毒的溶瘤效应的潜在机制也有待进一步阐明。之前本课题组已经利用反向遗传学系统成功拯救了重组麻疹病毒Hu191株（r-MV-Hu191。在本研究中，国内首次拟应用r-MV-Hu191株探索在胃癌中的溶瘤作用，并分析麻疹病毒抗肿瘤的凋亡机制，拟揭示麻疹病毒诱导的细胞凋亡与生物膜结构域脂筏之间的联系，为肿瘤治疗探索新思路。
研究方法:
1、利用工具细胞Vero对r-MV-Hu191株进行扩增，待有90％以上Vero细胞产生病变时，收集全部细胞和培养基，采用反复冻融、低温高速离心的方法收集r-MV-Hu191病毒液，应用空斑形成单位法测定病毒滴度。在r-MV-Hu191株感染人胃癌细胞株SGC-7901，BGC-823后的24h-48h，利用免疫荧光方法，检测病毒P蛋白表达情况，从而确定r-MV-Hu191株能够感染该胃癌细胞株。在r-MV-Hu191株感染人胃癌细胞株SGC-7901，BGC-823后的24h-96h，并且收集病毒液，利用半数组织培养感染剂量(TCID50)法检测麻疹病毒滴度，对该病毒在各种细胞上的增殖动力学进行研究。
2、在r-MV-Hu191株以不同感染复数(MOI)感染人胃癌细胞株SGC-7901，BGC-823后的24h-96h，通过倒置显微镜观察SGC-7901，BGC-823细胞的病变效应与合胞体的形成。应用CCK-8法检测细胞增殖活力。应用龙胆紫染活细胞的方法，检测细胞病变效应。
研究结果:
1、当r-MV-Hu191株的MOI为0.1时，通过MV-P蛋白的表达，可以看到病毒颗粒，从而证实该病毒可以成功感染BGC-823和SGC-7901细胞。此外，r-MV-Hu191株在两种细胞系中均能复制，BGC-823细胞感染48小时后达到滴度的峰值，SGC-7901细胞感染72小时后达到滴度的峰值。
2、在两个细胞系中，在感染后48小时内首次观察到细胞活力下降，而且r-MV-Hu191株的溶瘤作用呈现出剂量和时间依赖性。在感染病毒后的BGC-823和SGC-7901细胞中，当r-MV-Hu191的MOIs为0.1和1时，均以剂量和时间依赖性的方式引起了显著的细胞病变效应。
研究结论:
1、r-MV-Hu191株能在体外诱导细胞病变，抑制肿瘤增殖。
2、r-MV-Hu191株在体内能抑制肿瘤生长，延长裸鼠的生存时间。
3、r-MV-Hu191的复制需要脂筏，但病毒的吸附不需要脂筏。
4、在病毒与细胞结合之前，r-MV-Hu191诱导的细胞凋亡依赖于脂筏完整性。
5、r-MV-Hu191在体外和体内均可诱导caspase依赖的细胞凋亡。
第二部分 重组麻疹病毒沪191株（r-MV-Hu191株）联合顺铂治疗胃癌的作用及机制研究。
研究目的:
联合治疗模式能够产生超过任何一种单独方法的附加或协同效应。为了寻找一种能提高患者的耐受性和延缓耐药性，而且是安全有效的胃癌辅助治疗方法。我们在前一部分研究基础上，采用重组麻疹病毒Hu191株(r-MV-Hu191)联合化疗药顺铂(DDP)这种方式，探究该联合用药在胃癌细胞体内、外实验中的治疗作用。
研究方法:
1、利用工具细胞Vero对r-MV-Hu191进行扩增，待有90％以上Vero细胞产生病变时，收集全部细胞和培养基，采用反复冻融、低温高速离心的方法收集r-MV-Hu191病毒液，应用空斑形成单位法滴定病毒滴度。
2、 r-MV-Hu191联合DDP感染BGC-823和SGC-7901细胞72小时，采用CCK-8法测定胃癌细胞的存活率，采用个体剂量反应实验数据来计算ZIP评分。r-MV-Hu191联合DDP(按照以上计算出的最佳剂量)感染BGC-823和SGC-7901细胞24-72h，采用CCK-8法测定胃癌细胞的存活率。
3、病毒复制实验，BGC-823和SGC-7901细胞分别用r-MV-Hu191和DDP共处理24-72小时，取不同时间间隔的细胞和上清液，进行两次反复冻融。用TCID50方法在Vero细胞上进行滴定病毒浓度。BGC-823和SGC-7901细胞分别用r-MV-Hu191和DDP共处理0-24小时，用免疫荧光方法检测病毒P蛋白。
研究结果:
1、与单独使用r-MV-Hu191或DDP相比，r-MV-Hu191联合DDP治疗对两种细胞系的细胞毒性均显著升高。应用零相互作用效价强度(ZIP)分析，在BGC-823和SGC-7901细胞的所有剂量反应中，r-MV-Hu191与DDP的相互作用几乎都具有普遍的协同作用。当r-MV-Hu191的浓度在0.1MOI的剂量组合区域时，BGC-823细胞的协同效应最强，平均的ZIP协同得分为12.101。当DDP的浓度在2.8 uM的剂量组合区域时，SGC-7901细胞的协同效应最强，平均的ZIP协同得分为6.953。为了评估协同效应是否依赖于治疗时间，在联合处理48h时，r-MV-Hu191与DDP的协同作用首次出现，这种效应随着时间的推移而增强，对BGC-823和SGC-7901细胞的生长均产生了协同抑制作用。
2、在SGC-7901细胞中，DDP仅在24小时时导致病毒复制和病毒P蛋白表达水平略有降低，但在随后的时间内没有降低。对于BGC-823细胞，DDP对病毒复制和病毒P蛋白表达均无抑制作用。
3、与对照组相比，单独或联合应用r-MV-Hu191和DDP后，两种细胞系凋亡细胞比例均显著增加(P＜0.001)。此外，r-MV-Hu191联合DDP比单独使用r-MV-Hu191或DDP更能诱导细胞凋亡(P＜0.001)。在广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK的存在下，细胞凋亡的增加被部分逆转。与单独使用r-MV-Hu191或DDP处理相比，r-MV-Hu191和DDP联合处理在24小时和48小时时活化的caspase3和PARP的蛋白水平均升高。在联合处理72小时的实验中也证实了此前的观察结果，Z-VAD逆转了caspase3和PARP在联用组和r-MV-Hu191单用治疗组中的活化。
4、与对照相比，应用r-MV-Hu191(P＜0.05)或DDP单独治疗(P＜0.001)和联合治疗后第11天(P＜0.001)，都表现出对小鼠肿瘤的抑制作用。此外，与单独使用r-MV-Hu191或DDP相比，联合治疗后肿瘤体积明显缩小(P＜0.001，与r-MV-Hu191组相比，P＜0.01，与DDP组相比)。与对照相比，给予r-MV-Hu191或联合治疗可显著提高生存率(对照组中位生存期为18天，r-MV-Hu191组为23天，P＜0.01;联合治疗组为33天，P＜0.01）。然而，DDP组与对照组的生存率比较无显著差异(对照组中位生存时间为18天，DDP组中位生存时间为17天，P＞0.05)，联合治疗组较单独病毒治疗组的生存时间更长(P＜0.01)。与r-MV-Hu191和DDP单独治疗组相比，联合治疗组肿瘤组织中caspase3的表达水平较高。苏木精—伊红染色法(H&E)显示，对照组肿瘤细胞细胞密度很高，细胞核深染，细胞边界清晰。而用r-MV-Hu191治疗组的小鼠，肿瘤细胞密度较低。与对照组相比，仅用DDP治疗组的小鼠肿瘤核染色缺失，胞浆嗜酸性粒细胞增多，细胞微细结构和细胞边界丢失。与单独r-MV-Hu191或DDP治疗组相比，联合治疗可增强肿瘤肿块的细胞死亡和坏死症状。在免疫组织化学(IHC)分析中，与r-MV-Hu191和DDP治疗组相比，联合治疗组中活化的caspase3表达量增加。末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(TUNEL)分析显示，与单独使用r-MV-Hu191或DDP相比，r-MV-Hu191联合DDP治疗能诱导更多细胞凋亡。
5、与对照相比，DDP和联合治疗组小鼠的体重首次出现了减轻，联合组体重略重于DDP组，说明联用r-MV-Hu191可降低DDP的毒性。治疗组与对照组裸鼠的血清白蛋白(Alb)、血清球蛋白(Glb)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平无显著差异。
研究结论:
1、r-MV-Hu191联合DDP在体外能协同抑制人胃癌细胞生长。
2、DDP对MV复制无影响。
3、r-MV-Hu191联合DDP治疗显著增加胃癌细胞的凋亡。
4、r-MV-Hu191联合DDP治疗在体内是有效的。
5、r-MV-Hu191联合DDP治疗的副作用很小。
第一部分 重组麻疹病毒沪191株（r-MV-Hu191株）对胃癌溶瘤作用及其机制研究。
研究目的:
胃癌是世界上最常见的癌症之一，死亡率很高。尽管癌症死亡率在下降，但五年的总生存率仍然很低。因此，寻找有效的治疗方法，提高胃癌患者的生存率已成为当务之急。之前，许多不同种类的溶瘤病毒已被用来研究作为新的癌症治疗手段。Hu191是一种麻疹减毒活疫苗株，作为一种安全的疫苗在中国使用已超过50年，有报道称麻疹病毒Hu191株对肺癌有溶瘤作用，但尚未在其他恶性肿瘤中报道。而且麻疹病毒的溶瘤效应的潜在机制也有待进一步阐明。之前本课题组已经利用反向遗传学系统成功拯救了重组麻疹病毒Hu191株（r-MV-Hu191。在本研究中，国内首次拟应用r-MV-Hu191株探索在胃癌中的溶瘤作用，并分析麻疹病毒抗肿瘤的凋亡机制，拟揭示麻疹病毒诱导的细胞凋亡与生物膜结构域脂筏之间的联系，为肿瘤治疗探索新思路。
研究方法:
1、利用工具细胞Vero对r-MV-Hu191株进行扩增，待有90％以上Vero细胞产生病变时，收集全部细胞和培养基，采用反复冻融、低温高速离心的方法收集r-MV-Hu191病毒液，应用空斑形成单位法测定病毒滴度。在r-MV-Hu191株感染人胃癌细胞株SGC-7901，BGC-823后的24h-48h，利用免疫荧光方法，检测病毒P蛋白表达情况，从而确定r-MV-Hu191株能够感染该胃癌细胞株。在r-MV-Hu191株感染人胃癌细胞株SGC-7901，BGC-823后的24h-96h，并且收集病毒液，利用半数组织培养感染剂量(TCID50)法检测麻疹病毒滴度，对该病毒在各种细胞上的增殖动力学进行研究。
2、在r-MV-Hu191株以不同感染复数(MOI)感染人胃癌细胞株SGC-7901，BGC-823后的24h-96h，通过倒置显微镜观察SGC-7901，BGC-823细胞的病变效应与合胞体的形成。应用CCK-8法检测细胞增殖活力。应用龙胆紫染活细胞的方法，检测细胞病变效应。
研究结果:
1、当r-MV-Hu191株的MOI为0.1时，通过MV-P蛋白的表达，可以看到病毒颗粒，从而证实该病毒可以成功感染BGC-823和SGC-7901细胞。此外，r-MV-Hu191株在两种细胞系中均能复制，BGC-823细胞感染48小时后达到滴度的峰值，SGC-7901细胞感染72小时后达到滴度的峰值。
2、在两个细胞系中，在感染后48小时内首次观察到细胞活力下降，而且r-MV-Hu191株的溶瘤作用呈现出剂量和时间依赖性。在感染病毒后的BGC-823和SGC-7901细胞中，当r-MV-Hu191的MOIs为0.1和1时，均以剂量和时间依赖性的方式引起了显著的细胞病变效应。
研究结论:
1、r-MV-Hu191株能在体外诱导细胞病变，抑制肿瘤增殖。
2、r-MV-Hu191株在体内能抑制肿瘤生长，延长裸鼠的生存时间。
3、r-MV-Hu191的复制需要脂筏，但病毒的吸附不需要脂筏。
4、在病毒与细胞结合之前，r-MV-Hu191诱导的细胞凋亡依赖于脂筏完整性。
5、r-MV-Hu191在体外和体内均可诱导caspase依赖的细胞凋亡。
第二部分 重组麻疹病毒沪191株（r-MV-Hu191株）联合顺铂治疗胃癌的作用及机制研究。
研究目的:
联合治疗模式能够产生超过任何一种单独方法的附加或协同效应。为了寻找一种能提高患者的耐受性和延缓耐药性，而且是安全有效的胃癌辅助治疗方法。我们在前一部分研究基础上，采用重组麻疹病毒Hu191株(r-MV-Hu191)联合化疗药顺铂(DDP)这种方式，探究该联合用药在胃癌细胞体内、外实验中的治疗作用。
研究方法:
1、利用工具细胞Vero对r-MV-Hu191进行扩增，待有90％以上Vero细胞产生病变时，收集全部细胞和培养基，采用反复冻融、低温高速离心的方法收集r-MV-Hu191病毒液，应用空斑形成单位法滴定病毒滴度。
2、 r-MV-Hu191联合DDP感染BGC-823和SGC-7901细胞72小时，采用CCK-8法测定胃癌细胞的存活率，采用个体剂量反应实验数据来计算ZIP评分。r-MV-Hu191联合DDP(按照以上计算出的最佳剂量)感染BGC-823和SGC-7901细胞24-72h，采用CCK-8法测定胃癌细胞的存活率。
3、病毒复制实验，BGC-823和SGC-7901细胞分别用r-MV-Hu191和DDP共处理24-72小时，取不同时间间隔的细胞和上清液，进行两次反复冻融。用TCID50方法在Vero细胞上进行滴定病毒浓度。BGC-823和SGC-7901细胞分别用r-MV-Hu191和DDP共处理0-24小时，用免疫荧光方法检测病毒P蛋白。
研究结果:
1、与单独使用r-MV-Hu191或DDP相比，r-MV-Hu191联合DDP治疗对两种细胞系的细胞毒性均显著升高。应用零相互作用效价强度(ZIP)分析，在BGC-823和SGC-7901细胞的所有剂量反应中，r-MV-Hu191与DDP的相互作用几乎都具有普遍的协同作用。当r-MV-Hu191的浓度在0.1MOI的剂量组合区域时，BGC-823细胞的协同效应最强，平均的ZIP协同得分为12.101。当DDP的浓度在2.8 uM的剂量组合区域时，SGC-7901细胞的协同效应最强，平均的ZIP协同得分为6.953。为了评估协同效应是否依赖于治疗时间，在联合处理48h时，r-MV-Hu191与DDP的协同作用首次出现，这种效应随着时间的推移而增强，对BGC-823和SGC-7901细胞的生长均产生了协同抑制作用。
2、在SGC-7901细胞中，DDP仅在24小时时导致病毒复制和病毒P蛋白表达水平略有降低，但在随后的时间内没有降低。对于BGC-823细胞，DDP对病毒复制和病毒P蛋白表达均无抑制作用。
3、与对照组相比，单独或联合应用r-MV-Hu191和DDP后，两种细胞系凋亡细胞比例均显著增加(P＜0.001)。此外，r-MV-Hu191联合DDP比单独使用r-MV-Hu191或DDP更能诱导细胞凋亡(P＜0.001)。在广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK的存在下，细胞凋亡的增加被部分逆转。与单独使用r-MV-Hu191或DDP处理相比，r-MV-Hu191和DDP联合处理在24小时和48小时时活化的caspase3和PARP的蛋白水平均升高。在联合处理72小时的实验中也证实了此前的观察结果，Z-VAD逆转了caspase3和PARP在联用组和r-MV-Hu191单用治疗组中的活化。
4、与对照相比，应用r-MV-Hu191(P＜0.05)或DDP单独治疗(P＜0.001)和联合治疗后第11天(P＜0.001)，都表现出对小鼠肿瘤的抑制作用。此外，与单独使用r-MV-Hu191或DDP相比，联合治疗后肿瘤体积明显缩小(P＜0.001，与r-MV-Hu191组相比，P＜0.01，与DDP组相比)。与对照相比，给予r-MV-Hu191或联合治疗可显著提高生存率(对照组中位生存期为18天，r-MV-Hu191组为23天，P＜0.01;联合治疗组为33天，P＜0.01）。然而，DDP组与对照组的生存率比较无显著差异(对照组中位生存时间为18天，DDP组中位生存时间为17天，P＞0.05)，联合治疗组较单独病毒治疗组的生存时间更长(P＜0.01)。与r-MV-Hu191和DDP单独治疗组相比，联合治疗组肿瘤组织中caspase3的表达水平较高。苏木精—伊红染色法(H&E)显示，对照组肿瘤细胞细胞密度很高，细胞核深染，细胞边界清晰。而用r-MV-Hu191治疗组的小鼠，肿瘤细胞密度较低。与对照组相比，仅用DDP治疗组的小鼠肿瘤核染色缺失，胞浆嗜酸性粒细胞增多，细胞微细结构和细胞边界丢失。与单独r-MV-Hu191或DDP治疗组相比，联合治疗可增强肿瘤肿块的细胞死亡和坏死症状。在免疫组织化学(IHC)分析中，与r-MV-Hu191和DDP治疗组相比，联合治疗组中活化的caspase3表达量增加。末端脱氧核苷酸转移酶介导的三磷酸脱氧鸟苷-生物素刻痕末端标记(TUNEL)分析显示，与单独使用r-MV-Hu191或DDP相比，r-MV-Hu191联合DDP治疗能诱导更多细胞凋亡。
5、与对照相比，DDP和联合治疗组小鼠的体重首次出现了减轻，联合组体重略重于DDP组，说明联用r-MV-Hu191可降低DDP的毒性。治疗组与对照组裸鼠的血清白蛋白(Alb)、血清球蛋白(Glb)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平无显著差异。
研究结论:
1、r-MV-Hu191联合DDP在体外能协同抑制人胃癌细胞生长。
2、DDP对MV复制无影响。
3、r-MV-Hu191联合DDP治疗显著增加胃癌细胞的凋亡。
4、r-MV-Hu191联合DDP治疗在体内是有效的。
5、r-MV-Hu191联合DDP治疗的副作用很小。