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目的探讨胃癌细胞能否通过外泌体(Exosomes,Exos)介导的信息传递趋化和极化正常人中性粒细胞,为了解胃癌的生长和侵袭转移机理及抗肿瘤治疗提供新线索。方法用差速超速离心法分离纯化人胃癌细胞源性外泌体(MGC-803-Exos、SGC-7901-Exos、AGS-Exos)和人胃黏膜细胞来源的外泌体(GES-1-Exos),用透射电镜、Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术对所提取的外泌体进行鉴定。Western blot比较其中包含的趋化因子(CXC motif chemokine ligand-1、2、5、8,CXCL1、2、5、8)和干扰素-β(Interferon-β,IFN-β)、转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)含量的差异。用上述四种外泌体分别干预正常人中性粒细胞,共聚焦显微镜观察中性粒细胞对外泌体的摄取;q PCR和Western blot检测中性粒细胞表面趋化因子受体-1、2(CXC chemokine receptor type-1、2,CXCR1、2)m RNA和蛋白水平的变化;Transwell小室检测外泌体对中性粒细胞迁移能力的影响;q PCR、Western blot和ELISA检测与中性粒细胞极化相关的酶和因子如肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、细胞间黏附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil Elastase,NE)、基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase,MMP-9)、赖氨酰氧化酶(Lysyl oxidase,LOX)产生情况。人多通路磷酸化芯片检测胃癌细胞MGC-803源性外泌体干预中性粒细胞后相关信号通路的变化。结果1.细胞培养上清液中分离纯化的外泌体在透射电子显微镜下呈杯口状或双凹碟形。Western blot检测发现,外泌体高表达CD63和CD9,低表达β-actin,低表达或不表达细胞色素C。纳米颗粒跟踪分析显示,外泌体的粒径大小均在30-150nm之间,粒径峰值为120nm左右。2.Western blot检测发现外泌体中包含与中性粒细胞趋化相关的细胞因子CXCL1、2、5、8,以及极化相关的细胞因子TGF-β、IFN-β;胃癌细胞源性外泌体中CXCL1、2、5、8和TGF-β表达量高于人胃黏膜细胞来源的外泌体,P<0.05。3.激光共聚焦显微镜下可见外泌体被中性粒细胞摄取,随着共培养时间的延长中性粒细胞胞浆内绿色荧光增加。4.Transwell小室实验发现,加入4种细胞来源的外泌体均可增强中性粒细胞迁徙能力,P<0.05;并且随着外泌体剂量的增加,中性粒细胞的迁徙能力也逐渐增强,P<0.05;胃癌细胞源性外泌体较人胃黏膜细胞来源的外泌体有更强的促进中性粒细胞迁移的作用,P<0.05。5.q PCR和Western blot检测发现,与对照组相比加入100、200μg胃癌细胞源性外泌体可上调CXCR1、CXCR2 m RNA和蛋白相对表达量,P<0.05。人胃黏膜细胞源性外泌体200μg可增加CXCR1和CXCR2相对表达量,P<0.05。6.随着AGS-Exos、SGC-7901-Exos剂量的增加,中性粒细胞LOX、MMP-9、NE m RNA水平、蛋白相对表达量及其分泌量均逐渐升高,P<0.05;TNF-α、ICAM-1、ROS m RNA水平下调,TNF-α、ICAM-1蛋白相对表达量及其分泌量均逐渐降低,P<0.05。当MGC-803-Exos剂量为100μg或200μg时,上调中性粒细胞NE、MMP-9、LOX m RNA、蛋白相对表达量及分泌量,P<0.05;下调ROS、TNF-α、ICAM-1 m RNA表达水平,减少TNF-α、ICAM-1蛋白相对表达量及分泌量,P<0.05。当MGC-803-Exos剂量为50μg时发现,中性粒细胞TNF-α、ICAM-1蛋白相对含量增高,TNF-α蛋白分泌量增高,P<0.05;MMP-9、LOX、NE蛋白相对含量减少,MMP-9蛋白分泌量减少,P<0.05。7.人多通路磷酸化芯片检测发现外泌体可能通过PI3K-Akt、Erb B等多条信号通路诱导中性粒细胞极化为N2型。结论胃癌细胞源性外泌体中包含对中性粒细胞有趋化作用的CXCL1、2、5、8和有极化作用的TGF-β、IFN-β。胃癌细胞源性外泌体可通过增强中性粒细胞迁移和趋化因子受体CXCR1、CXCR2的表达而趋化中性粒细胞,并诱导中性粒细胞通过上调LOX、MMP-9、NE,下调TNF-α、ICAM-1、ROS,发挥N2型TANs的促肿瘤作用。外泌体对中性粒细胞的影响可能通过PI3K-Akt等多条信号通路。