论文部分内容阅读
人胚胎干细胞( human embryonic stem cell, hES )是一种取自人囊胚内细胞团,经体外分离、培养获得的一种多能干细胞。它具有体外无限增殖和多向分化潜能两个基本特点。生物支架材料是种子细胞在形成组织之前赖以生存和依附的三维支架,为细胞的增殖、分化、营养交换、新陈代谢以及细胞外基质分泌等生理活动提供空间场所。用于组织工程的多孔支架材料必需具备良好的生物相容性。因此,以人胚胎干细胞为种子细胞、丝素蛋白为支架的复合体在组织工程研究领域具有广阔的前景。本文探讨了人胚胎干细胞系—HUES-17细胞结合丝素材料向神经细胞分化的可行性和生物相容性。实验首先探讨了人胚胎干细胞与丝素材料结合的可行性及生物相容性。我们将HUES-17细胞培养于丝素材料培养体系上,通过观察比较、克隆形成率分析、群体倍增时间分析、碱性磷酸酶检测、免疫荧光染色、体外分化等方法研究了丝素材料对人胚胎干细胞的黏附、生长情况、未分化状态的维持、胚胎干细胞特性、分化等方面的影响。结果显示:(1)HUES-17细胞能在丝素材料上形成典型的克隆,边界清晰,核质比较高;(2)克隆形成率(0.2967±0.0272%)和群体倍增时间(47.25±1.40 hrs),与常规培养体系无显著差别;(3)胚胎干细胞未分化检测指标碱性磷酸酶和Oct-4检测为阳性;(4)体外能分化成多种类型的细胞。以上实验证实了人胚胎干细胞能在丝素材料上生长并维持其未分化状态,并且经诱导后能在丝素材料上自发分化成多种类型的细胞,表明丝素材料与人胚胎干细胞具有良好的生物相容性,为人胚胎干细胞应用于组织器官的修复和移植治疗时作为支架材料提供实验依据。在保证了丝素材料与人胚胎干细胞具有生物相容性的前提下,实验将HUES-17细胞结合丝素材料向神经细胞定向诱导分化,研究人胚胎干细胞来源的神经细胞与丝素材料的生物相容性。实验选用目前较为成熟的诱导方案:将HUES-17细胞悬浮培养7 d的EBs接种于明胶包被的培养皿,用N2培养基培养,10-14 d以后,用机械法将呈灶状生长的细胞团分离出来,再用N2培养基培养悬浮培养10 d,得到神经球样细胞团,将此细胞团吹打成单细胞后接种至丝素材料上再进行神经细胞的诱导。采用上述方法,我们得到大量纯净的nestin阳性细胞,即神经前体细胞。在神经诱导液的诱导下神经前体细胞在丝素材料上进一步成熟分化为β-III-tubulin阳性的神经元。我们将nestin阳性的神经球吹打成单细胞后接种于多聚赖氨酸(polylysine, PLL)和丝素材料上,比较了人胚胎干细胞来源的神经前体细胞在丝素材料上的分化比率,结果显示,消化成单细胞后的神经前体细胞在PLL和丝素材料上分化成成熟神经元的比率均在70%以上,而且两者无显著性差异。以上实验结果表明丝素材料可作为人胚胎干细胞来源的神经前体细胞向神经细胞分化的支架材料,为胚胎干细胞来源的神经细胞结合组织工程,最终用于神经系统退行性疾病的临床治疗提供实验依据。