论文部分内容阅读
T细胞免疫反应在控制HIV感染中具有重要作用，单核细胞增多性李斯特细菌(Listeria monocytogenes，Lm)能诱导机体产生很强的细胞免疫应答，近年来颇受关注。由于李斯特菌对人和动物具有致病性，需要对菌体本身进行改造保证其安全性之后才能作为递呈目的蛋白的疫苗载体使用。本研究以Lm actA为靶基因，以HIV-1 gag为外源基因，应用同源重组技术构建表达gag并缺失actA的重组减毒Lm，并对其生物学特征和免疫学特性进行初步探讨和比较研究。
1.actA缺失型李斯特细菌载体HIV疫苗的构建采用PCR方法从Lm10403s基因组中扩增出actA基因的启动子区域(P)和终止子区域(T)，分两步插入至穿梭载体pKSV7中，从质粒pVI75gagpolenv中采用PCR方法扩增gag基因，将gag基因插入至pKSV7-P-T。经测序鉴定正确后，分别电转化至感受态Lm野生型、Lm△sepA、Lmdd△sepA中，经过氯霉素和高温双重选择压力实现同源重组，得到重组菌Lm△actA-gag、Lm△sepA/△actA-gag、Lmdd△sepA/△actA-gag。应用2对引物对重组菌进行PCR鉴定，结果显示外源基因gage定点整合于载体菌基因组中。Western blot结果表明HIV-1 gag基因已经在Lm中得到正确表达和分泌。
2.体外实验表明重组李斯特细菌能感染并在J774A.1细胞中增殖对3株携带gag基因的重组细菌Lm△actA-gag、Lm△sepA/△actA-gag、Lmdd△sepA/AactA-gag以及本科室构建的LmddBsdalHIVgag进行了体外感染J774A.1细胞实验。结果表明这些菌株都能感染小鼠巨噬细胞并表达Gag蛋白，其中，Lm△actA-gag在细胞内增殖最快，Gag蛋白表达量达500 pg/7×105细胞；Lmdd△sepA/△actA-gag因无D-Ala在细胞中几乎不增殖，Gag蛋白表达量也最低；Lm△sepA/△actA-gag和LmddBsdalHIVgag增殖速率相似，Gag蛋白表达量分别为300 pg/7×105细胞、450 pg/7×105细胞。
3.actA缺失型李斯特细菌载体HIV疫苗对BALB/c小鼠的毒力较野生型有大幅度下降野生型对BALB/c小鼠的致死率在103CFU-104CFU之间，四株重组菌相比野生型Lm毒力均有大幅下降。当接种剂量为1×108CFU时，接种Lm△actA-gag和LmddBsdalHIVgag的小鼠均死亡，接种Lm△sepA/△actA-gag和Lmdd△sepA/△actA-gag的小鼠全部存活。低于1×108CFU剂量时，四种菌株感染的小鼠全部存活，但表现出一定的病理特征，当剂量为5×107CFU时，Lm△actA-gag的毒力最大，免疫后小鼠体重下降约20％；Lmdd△sepA/△actA-gag为营养缺陷型菌株，其毒力最小；免疫LmddBsdalHIVgag、Lm△sepA/△actA-gag后小鼠体重分别下降15％和5％。
4.actA缺失型李斯特细菌载体HIV疫苗单独或与痘苗病毒载体HIV疫苗(rTV)联合免疫后小鼠后产生强烈细胞免疫反应研究发现，本文构建的重组Lm疫苗单独免疫小鼠就可以产生较强的细胞免疫反应，其中Lm△actA-gag最强，诱导分泌特异性IFN-γ的细胞数为930±41sfu/106细胞；Lmdd△sepA/△actA-gag最弱，27±25 sfu/106细胞；Lm△sepA/△actA-gag和LmddBsdalHIVgag分别为808±229 sfu/106细胞和767±238 sfu/106细胞；采用痘苗病毒载体HIV疫苗(rTv)初次免疫，Lm重组疫苗加强的联合免疫策略可以激发超强的细胞免疫反应，其中，1×rTV+2×Lm△actA-gag免疫组合所诱导的特异性IFN-γ和TNF-αCD8+T细胞百分值高达1.3％，其余则在0.2％到1.0％之间。此外，实验还发现重组Lm疫苗免疫小鼠一次，两次或三次所诱导的特异性细胞免疫反应无显著差异。
综上所述，本文构建了Lm△actA-gag、Lm△sepA/△actA-gag、Lmdd△sepA/△actA-gag3种重组Lm疫苗，这些细菌载体HIV候选疫苗的毒力较野生型下降了3-4个数量级，重组Lm疫苗能够感染小鼠并激发强烈的细胞免疫反应，若与痘苗病毒载体HIV疫苗联合免疫小鼠则能产生更强的细胞免疫反应。