论文部分内容阅读
第一部分人源脱细胞动脉基质的制备及其组织学特点目的：通过制备人源脱细胞动脉基质及胆道基质,观察其组织学特点并比较差异,筛选合适的组织工程胆道修复材料。方法：利用昆明医科大学附属甘美医院公民心脏死亡后器官捐献获得的脾动脉组织、部分腹主动脉和肝外胆道组织,使用1%十二烷基磺酸钠、1%聚乙二醇辛基苯基醚、0.25%胰酶进行脱细胞处理,使用苏木精—伊红染色观察人源动脉及肝外胆道组织脱细胞前、后组织学特点,使用扫描电子显微镜观察脱细胞后的动脉组织及肝外胆道组织的组织学特点。提取脱细胞前、后的动脉及肝外胆道组织的总DNA,分光光度计定量测定DNA含量,比较差异。结果：脱细胞后的动脉组织与肝外胆道组织苏木精—伊红染色未见明显的细胞残留,与未脱细胞的组织相比具有明显的组织学差异。扫描电子显微镜下,脱细胞后的动脉组织细胞外胶原纤维完整,分层清晰,具有较好的孔隙率,脱细胞后的脾动脉内膜厚度为114.83±21.67μm,脱细胞后的肝外胆道组织内膜厚度为19.87±4.52μm,二者比较差别具有统计学意义(P=0.000)。脱细胞后脾动脉及肝外胆道组织DNA含量明显降低,与未脱细胞处理的相应组织相比,差异均具有统计学意义(P=0.000,P=0.000)。结论：1%十二烷基磺酸钠、1%聚乙二醇辛基苯基醚、0.25%胰酶能够有效脱去人源动脉及肝外胆道组织中的细胞成分,并且保持了完好的细胞外结构,与脱细胞肝外胆道组织相比,脱细胞后的动脉组织具有更厚的内膜、更好的孔隙率,并且与未脱细胞的处理的组织相比,其DNA含量明显减少。由于动脉组织更易获取,且单一捐献者能获取的动脉组织较肝外胆道更为丰富,因此人源脱细胞动脉基质是理想的组织工程胆道的生物支架。第二部分大鼠肝卵圆细胞的分离、培养、鉴定及定向诱导分化为胆管上皮细胞目的：通过体外分离、培养并定向诱导大鼠肝卵圆细胞分化为胆管上皮细胞,获取用于组织工程研究的种子细胞。方法：使用2-乙酰氨基芴喂食+肝部分切除术方法建立大鼠卵圆细胞活化模型,利用蛋白酶E、胶原酶Ⅳ对活化后的大鼠肝脏进行消化,提取原代肝卵圆细胞,使用表皮生长因子、白血病抑制因子以及干细胞生长因子联合方案诱导大鼠肝卵圆细胞,在体外传代过程中,观察细胞形态变化,使用流式细胞检测不同代次细胞标志OV-6、CK-19,应用免疫荧光显微镜观察不同代次细胞OV-6、CK-19表达,应用实时荧光定量PCR检测不同代次细胞中CK-19、γ-GT、AFP、ALB mRNA表达情况。结果：从大鼠肝脏中提取的原代细胞,形态符合肝卵圆细胞特点,OV-6阳性细胞比例为94.30±1.40%, CK-19阳性细胞比例为3.16±1.87%,通过体外诱导,细胞传至第6代时,OV-6阳性细胞比例为4.97±0.21%,CK-19阳性细胞比例为96.17±1.21%,与原代细胞相比,差异具有统计学意义。免疫荧光显微镜观察提示随着细胞代次的增加,OV-6阳性细胞表达逐渐减少,CK-19阳性表达细胞逐渐增多,并且CK-19阳性细胞形态变化符合肝卵圆细胞向胆管上皮细胞分化过程；QRT-PCR检测第2、8、10、12代细胞中CK-19、γ-GT、AFP、ALB mRNA相对表达量,与第2代细胞相比,第12代细胞中CK-19、γ-GT、AFP、ALB mRNA相对表达量(RQ值)分别为5.3471±0.1057、3.4820±0.2393、0.1980±0.0131、0.6724±0.1700,差异具有统计学意义。结论：利用体外培养及表皮生长因子、干细胞生长因子、白血病抑制因子联合诱导方案,成功将OV-6阳性的大鼠肝卵圆细胞诱导分化为CK-19阳性的胆管上皮细胞,细胞形态及表面标志变化及相关基因表达符合肝卵圆细胞向胆管上皮细胞分化的特点。第三部分胆管上皮细胞在体外培养条件下与脱细胞动脉基质的复合生长目的：通过将诱导后的胆管上皮细胞种植于制备的人源脱细胞动脉基质,在体外培养条件下,观察胆管上皮细胞与脱细胞动脉基质的相容性及胆管上皮细胞的生长情况。方法：将制备的脱细胞动脉基质修剪成大小1×1cm大小,培养基浸泡24小时后,将诱导后的胆管上皮细胞调整浓度为5×106/ml,将0.2ml细胞悬液接种于脱细胞动脉基质,37℃培养箱中静置4小时后加入培养基浸没脱细胞动脉基质。种植后4、6、8周,利用免疫荧光显微镜和扫描电子显微镜,观察胆管上皮细胞在脱细胞动脉基质上的生长情况。结果：种植后的第4周,可观察到胆管上皮细胞在脱细胞动脉基质上生长良好,CK-19阳性细胞尚未完全覆盖脱细胞动脉基质,种植后第8周,可见CK-19阳性胆管上皮细胞已完全覆盖1×1cm的脱细胞动脉基质,扫描电子显微镜下,生长良好的胆管上皮细胞已形成上皮样结构。结论：人源脱细胞动脉基质与大鼠来源的诱导胆管上皮细胞在体外培养条件下具有良好的相容性,脱细胞动脉基质能够为作为胆管上皮细胞体外生长的生物支架,胆管上皮细胞在体外培养条件下覆盖1×1cm的脱细胞动脉基质约需要8周的时间。第四部分异种脱细胞动脉基质修复滇南小耳猪肝外胆道缺损的实验研究目的：通过使用人源脱细胞动脉基质对滇南小耳猪肝外胆道缺损模型进行修复,观察异种脱细胞动脉基质对肝外胆道缺损的修复效果,并对修复的机制进行探讨。方法：10只封闭群滇南小耳猪随机分为A、B、C组,A组(n=4)利用异种脱细胞动脉基质对肝外胆道缺损进行修复,B组(n=4)进行胆道横断后端端吻合,C组(n=2)作为空白对照组。术后不同时点抽取静脉血检测血清碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、总胆红素水平并比较组间差异。术后12周处死实验动物,对修补后的肝外胆道进行取材,HE染色观察肝外胆道组织学特点,并应用免疫组化技术,观察修补后的肝外胆道中CK-19、TGF-β1、CTGF、VEGF表达,利用Image Pro Plus软件包,比较组间免疫组化切片累积光密度值差异,并利用扫描电子显微镜,观察修补肝外胆道缺损后脱细胞动脉基质黏膜面细胞生长情况。结果：A组实验动物中,1只实验动物于术后61天死亡,其余实验动物在12周内无死亡。A组实验动物血清总胆红素、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶与B、C组比较,差别有统计学意义。免疫组化提示A组肝外胆道中CK-19、TGF-β1、 CTGF、VEGF表达差别有统计学意义。修补肝外胆道12周后的脱细胞动脉基质中,有大量受体细胞长入,并且有少量新生血管,扫描电镜观察到脱细胞动脉基质内膜面有类似胆管上皮细胞生长,但结构不完整。结论：人源脱细胞动脉基质在修补滇南小耳猪肝外胆道缺损12周后,能够部分重建缺失的肝外胆道结构,并能部分重建血供,受体与异种脱细胞动脉基质相容性良好,胆管上皮细胞能够在脱细胞动脉基质表面部分再生。但脱细胞动脉基质修复后的肝外胆道与正常胆道仍有较大差异,仅能实现结构重建,若期望达到功能重建的目的,尚需进一步研究。