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目的：
当前,艾滋病病人及其病毒HIV-1型携带者的数目逐渐增多,急需一种优质廉价的诊断试剂来预防和监测。目前,针对HIV-1感染的检测主要是抗体和核酸检测,国内主要是进行抗体检测,包括病人血液和尿液中的抗体。HIV-1结构基因env编码的跨膜糖蛋白GP41是病毒表面抗原,可诱导机体产生特异性抗体。因此,在大多数艾滋病诊断试剂中GP41抗原都是主要标记物之一。本实验通过构建基因重组GP41抗原,为生产研制抗HIV-1抗体诊断试剂提供优质抗原。
方法：
本实验首先通过PCR方法,从含有GP41全长基因片段的质粒中扩增出包含主要抗原表位的GP41截短体基因片段,先后插入到原核表达载体pET-28a和pGEX-4t-2中构建表达质粒,转入大肠杆菌BL21感受态后用IPTG进行诱导表达。先进行小量诱导以确定目的蛋白是否表达,确定目的蛋白能表达后扩大诱导表达量以进行下一步的纯化。用镍亲和树脂和GST亲和树脂亲和层析纯化目的蛋白。最后,通过Western-blot和ELISA方法对重组蛋白的抗原性进行验证。
结果：
成功构建了pET-28a-GP41和pGEX-4t-2-GP41表达质粒。但是,pET-28a-GP41表达质粒在BL21中不能有效的表达,尝试了不同的诱导时间,温度,IPTG的浓度仍不能诱导产生重组蛋白。而随后构建的pGEX-4t-2-GP41表达质粒在BL21中可以获得高效表达,重组蛋白占茵体总蛋白的29.37%,主要以包涵体形式存在,可溶性重组蛋白只占目的蛋白的一小部分。分别对可溶部分和包涵体部分的蛋白进行提取纯化。经Westtern-blot和ELISA检测,可溶部分和包涵体部分的重组蛋白均具有很的抗原活性。
结论：
本实验通过构建pET-28a-GP41和pGEX-4t-2-GP41表达质粒,对GP41蛋白进行截短表达,实验发现,pET-28a-GP41表达载体在BL21中不能进行有效的表达,pGEX-4t-2-GP41表达载体在BL21中获得高效表达,并且分别对可溶性蛋白和包涵体形式的蛋白进行分析发现,两者均具有抗原性,包涵体蛋白无需变形、复性等步骤也可具有抗原活性。本实验获得了GP41截短体在大肠杆菌中的高效表达,通过Western-blot和ELISA分析,证明重组蛋白有很好的抗原特异性,为以抗HIV-1抗体为基础的检测试剂的研发奠定了基础。