论文部分内容阅读
目的:溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）是一种病因尚未明确的非特异性炎性肠病,常发生于结、直肠,以腹痛、腹泻、里急后重及便下脓血为主要临床特点,反复发作且具有恶变倾向,已被WHO列为难治性疾病。对于本病的治疗,现有的西医治疗方案尚不能有效的控制UC发作,特别是在预防复发方面很不理想,伴随着治疗周期长,药物副反应大、治疗费用高昂等弊端,中医药对于UC的治疗在临床中收到了显著疗效。靛玉红作为中药青黛中的有效成分,是一种双吲哚类化合物,目前对其研究证实其具有抗肿瘤、抗炎等作用。本实验通过研究中药青黛中有效成分靛玉红对三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇溶液诱导的UC模型大鼠的治疗作用,并应用分子生物学手段,观察靛玉红对大鼠结肠组织中MEK/ERK信号通路、PI3K/AKT信号通路的调节作用,以深入探讨其治疗作用机理。方法:本研究采用48只清洁级SD大鼠,♂,体质量（200±20）g,随机分为4组,分别为正常组、模型组、靛玉红组、柳氮磺吡啶（SASP）组。利用三硝基苯磺酸（TNBS）/乙醇法建立UC模型大鼠,治疗21d后对大鼠进行疾病活动指数（DAI）评分,对大鼠结肠组织进行肉眼下大体组织观察及电镜下HE染色病理涂片观察,利用ELISA技术检测大鼠结肠粘膜髓过氧化物酶（MPO）、转化生长因子β1（TGF-β1）水平,利用RT–PCR法检测大鼠肠三叶因子（ITF）mRNA、碱性成纤维生长因子（bFGF）mRNA表达水平、利用RT-PCR及Western blot检测技术检测大鼠结肠粘膜MEKmRNA、ERKmRNA、PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK、p-AKT蛋白表达水平。结果:1.靛玉红对UC模型大鼠DAI评分影响与正常组相比,模型组DAI评分明显升高（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组、SASP组DAI评分均有明显降低（p<0.01）;与SASP组比较靛玉红组的DAI评分,差异无统计学意义（p>0.05）。2.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织结肠组织大体形态学观察、病理学HE染色的影响正常组大鼠自直肠至回盲末端均未见明显异常,见结肠肠腔通畅,无溃疡痕迹,粘膜未见充血、水肿。模型组可见巨大而深的溃疡面,受损肠壁坚硬,弹性差,呈黑褐色,近端结肠可见少量粪块滞留,溃疡面周围见粘膜水肿。经靛玉红及SASP治疗后的UC模型大鼠的结肠黏膜未见明显的溃疡面,粘膜色泽接近正常,仅于距肛门8cm处见少量粘膜充血、水肿。对大鼠结肠组织进行HE染色后发现,正常组大鼠结肠黏膜上皮完整,结构清晰,腺体排列规则,固有膜内杯状细胞丰富,未见炎症细胞浸润;模型组大鼠结肠病变组织溃疡深度可及粘膜肌层,结构破坏,隐窝细胞丢失上皮细胞脱落、坏死;固有层腺体萎缩,排列紊乱,有些腺体甚至完全丧失;黏膜及黏膜下层可见大量炎性细胞浸润,且浸润全层;经靛玉红及阳性药物SASP干预后,UC模型大鼠结肠中性粒细胞及淋巴细胞浸润较模型组少,可见少量腺管扭曲,黏膜炎细胞浸润程度、腺体结构紊乱、上皮细胞缺失及溃疡程度等情况均有不同程度的改善。3.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织中MPO水平的影响与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中MPO水平明显升高（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组及SASP组结肠组织中MPO水平明显降低（p<0.01）,而靛玉红组与SASP组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。4.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织TGF-β1水平的影响与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中TGF-β1含量明显增高（p<0.01）。各治疗组大鼠结肠组织中TGF-β1含量均低于模型组（p<0.01）。而靛玉红组大鼠结肠组织中TGF-β1含量与SASP组相比,差异无统计学（P>0.05）。5.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织ITFmRNA与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中ITFmRNA表达水平明显降低（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组及SASP组结肠组织中ITFmRNA表达水平明显增高（p<0.01）,而靛玉红组与SASP组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。6.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织bFGFmRNA与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中bFGFmRNA表达水平明显升高（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组及SASP组结肠组织中bFGFmRNA表达水平明显升高（p<0.01）,而靛玉红组与SASP组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。7.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织MEKmRNA、ERKmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK蛋白表达水平影响与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中MEKmRNA、ERKmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK蛋白表达水平均明显降低（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组及SASP组结肠组织中MEKmRNA、ERKmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK蛋白表达水平明显增高（p<0.01）,而靛玉红组与SASP组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。8.靛玉红对UC模型大鼠结肠组织PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-AKT蛋白表达水平的影响与正常组相比,模型组大鼠结肠组织中PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-AKT蛋白表达水平均明显升高（p<0.01）。与模型组相比,靛玉红组及SASP组结肠组织中PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-AKT蛋白表达水平明显降低（p<0.01）,而靛玉红组与SASP组相比较,差异无统计学意义（P>0.05）。结论:1.靛玉红可以抑制UC模型大鼠肠道炎症症状靛玉红通过降低大鼠DAI评分,证明了靛玉红可以减轻UC模型大鼠肠道炎性症状,改善UC模型大鼠生存质量,验证了靛玉红对UC模型大鼠治疗的有效性。对大鼠结肠粘膜肉眼下观察大体形态,经靛玉红治疗UC模型大鼠结肠受损的溃疡粘膜愈合,改善结肠黏膜充血、水肿状态。相比于未经治疗的UC模型大鼠结肠粘膜所出现的巨大而深的溃疡面,黑褐色弹性差的肠管,治疗组大鼠结肠组织恢复良好。以此直观证明靛玉红对UC模型大鼠受损溃疡的修复功能。对大鼠结肠粘膜HE染色图片发现,经靛玉红的治疗,UC模型大鼠结肠粘膜炎症反应仅表现为少量的中性粒细胞及淋巴细胞浸润,相比于未经治疗的UC模型大鼠结肠黏膜所出现的黏膜炎细胞浸润深至粘膜肌层、腺体结构紊乱、上皮细胞缺失及溃疡程度等情况均有大幅度程度的改善。以此可以直观的证明靛玉红对UC模型大鼠结肠受损组织修复功能,以及抑制炎症的功能。2.靛玉红能下调UC模型大鼠结肠组织中TGF-β1水平TGF-β1作为生长因子超家族中的一员,具有调节细胞免疫的作用,其表达与UC疾病严重程度呈正比。靛玉红通过下调UC模型大鼠结肠组织中TGF-β1的含量,一方面可以抑制炎症细胞对UC模型大鼠结肠损伤,另一方面起到了促结肠上皮溃疡创面的愈合,组织修复的作用。3.靛玉红能下调UC模型大鼠结肠组织中MPO水平靛玉红通过下调UC模型大鼠结肠组织中MPO水平,可以说明靛玉红可有效控制UC炎症症状,减少炎性细胞浸润,MPO作为中性粒细胞嗜天青颗粒的重要组成部分,是粒细胞聚集的指标,其含量与UC肠道炎症水平呈正相关。4.靛玉红能上调UC模型大鼠结肠组织ITFmRNA表达。通过靛玉红能通过上调UC模型大鼠结肠组织ITFmRNA表达,一方面,可以说明靛玉红具有抑制肠粘膜细胞凋亡的作用,另一方面,具有对UC模型大鼠受损肠粘膜进行修复、调节细胞免疫的作用。5.靛玉红能上调UC模型大鼠结肠组织bFGFmRNA表达模型组大鼠结肠组织bFGFmRNA表达较正常组明显升高,从一个侧面说明了造模的有效性,因为在正常大鼠结肠组织中bFGFmRNA表达量极少或不表达,而由于其促炎作用的产生,通过激发NO等炎性介质介导级联反应,使得模型组大鼠结肠组织中bFGFmRNA表达量提高。通过靛玉红的治疗能够继续上调UC模型大鼠结肠组织bFGFmRNA表达,说明靛玉红能够增加血管生长因子量,从而促进新的血管生成,恢复受损粘膜完整性。6.靛玉红能提高UC模型大鼠结肠组织MEKmRNA、ERKmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK蛋白表达水平经靛玉红治疗,可明显提高UC模型大鼠结肠组织MEKmRNA、ERKmRNA表达水平及p-MEK、p-ERK蛋白表达水平,说明靛玉红可以激活MEK/ERK信号通路,发挥其抑制细胞凋亡、促进肠粘膜细胞分化,抑制炎症反应的作用。7.靛玉红能调低UC模型大鼠结肠组织PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-AKT蛋白表达水平靛玉红通过降低UC模型大鼠结肠组织PI3KRNA、AKTmRNA表达水平及p-AKT蛋白表达水平,说明靛玉红可以激活PI3K/AKT信号通路,特别是能标志性的将AKT磷酸化,完整的激活通路,发挥其抑制细胞凋亡的作用,以抑制炎症细胞进一步浸润。综上所述,靛玉红对UC模型大鼠可进行有效的治疗,其机制可能是通过下调TGF-β1、下调MPO表达水平,提高bFGFmRNA、ITFmRNA表达,激活MEK/ERK信号转导通路、PI3K/AKT信号通路,进而抗肠道细胞凋亡,抑制肠道炎症症状,促进UC所导致的肠道受损黏膜修复的作用。