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恶性肿瘤严重威胁人类的生命与健康，其发病率和死亡率在世界许多国家和地区居首位。据世界卫生组织报道，癌症是世界范围内致死率最高的疾病，2008年，约有760万人死于癌症，占世界所有死亡人数的13％。并且癌症引起的死亡率在持续上升，预计到2020年全球肿瘤发病率将上升50％，癌症病人将增加近1500万，恶性肿瘤将成为21世纪危害人类健康的头号杀手。此外，在过去的二十年中，仅我国每年就有新增癌症患者180万，死亡120万，且呈急剧上升态势。恶性肿瘤是病因、病理、临床表现以及治疗均比较复杂的一类常见病、多发病，所以彻底征服癌症是全球性医药卫生工作的一项艰巨任务。目前，抗癌药物依然是肿瘤治疗的主要手段之一，而寻找毒副作用小、抗肿瘤活性好、生物利用度高的抗肿瘤新药日益成为制药公司新药研发的目标，其中，寻找抗肿瘤活性小分子并阐明其机制是新药研发阶段不可或缺的重要环节。 我们以肿瘤细胞株作为评价小分子抗肿瘤活性的细胞模型，通过MTT细胞毒性分析筛选得到四类抑制肿瘤细胞增殖的活性小分子。随后，我们分别选取不同类化合物中具有较好活性的小分子进行抗肿瘤机制研究。 第一类化合物Bengamides是Crews等人于1986年从海绵。Jaspiscfcoriacea中分离得到的天然产物，其具有独特的化学结构和较好的广谱抗肿瘤活性，我们对其作用机制进行了探讨。首先，通过构效关系研究设计并合成了具有更好水溶性、更简易合成路线和较好抗增殖活性的Bengamide类似物L538。细胞增殖抑制活性检测结果表明，L538处理48h没有导致细胞明显死亡，而72h处理则出现大量死亡。此外，10μML538处理48h的细胞仅比DMSO处理组少20％，表明L538没有完全导致细胞周期停滞。2000年的一篇会议摘要中发现BengamideE可导致周期同步化细胞阻滞于G1/S期检验点和G2/M期，并认为BengamideE引起了G1/S期阻滞和G2/M期阻滞。此外，2003年以及2007年的文献中认为甲硫氨酰氨肽酶1和2(MetAP1and2)是Bengamides的作用靶点且Bengamides通过抑制MetAP1和2影响了c-Src定位进而引起G2/M期延长和细胞增殖抑制。我们发现，在双胸苷阻断法同步化的HeLa细胞上L538导致与2000年摘要中相同的细胞周期变化，但抑制MetAP1和2并没有导致相同的周期变化。此外在饥饿48h同步化于G0/G1期的HeLa细胞上L538没有导致明显的G1/S期阻滞而是减慢了G1-S期转变。据此推测，L538所导致的双胸苷阻断法同步化的HeLa细胞阻滞于G1/S期没有真实反映其对细胞周期过程的影响，而对DNA复制应激相关信号通路的检测结果表明L538影响状态的恢复。通过对DNA复制应激相关信号分子Chk1去磷酸化的检测，确定了释放7h细胞状态基本恢复，而此时加入L538则引起一定程度的G1期向S期转变减慢而非G1/S期阻滞。对未经同步化处理的HeLa细胞的细胞周期相关蛋白检测结果表明，L538影响了诸多细胞周期相关蛋白如CDK2、CDC2、E2F1以及c-Myc等的蛋白水平，而这可能是Bengamide导致G1/S期运转变慢的原因。此外，基于构效关系研究设计合成了保留较好活性的小分子探针LX886，细胞原位标记和细胞裂解液标记表明成功钓取Bengamide特异性作用靶蛋白，而对Bengamide作用靶蛋白的质谱鉴定工作还在继续中。 第二类化合物是香豆素类似物。香豆素及其类似物广泛分布于自然界，其具有抗肿瘤、抗病毒、抗微生物以及抗凝血等多种活性，不同基团取代的香豆素类似物可能具有不同活性，而香豆素所具有的临床应用潜力使其成为新药研发的热点。基于以上认识，我们设计合成了一系列香豆素类似物并在结肠癌HCT116细胞上检测细胞毒性。结果表明，6-氯-4-(甲氧基)香豆素(简称CMC)具有最好抗肿瘤活性，其IC50值约为200nM。此外，CMC在6个不同组织来源的9株肿瘤细胞株上具有较好细胞毒性，其IC50值介于75nM和1.57μM之间；而在人胚肺细胞株WI-38上毒性较小，IC50值仅为12.13μM，表明CMC具有一定的肿瘤细胞选择性。其中，CMC在HeLa、MDA-MB-435S、A431以及HCT15细胞上具有最好活性。为研究其作用机制，我们选取HeLa细胞株作为评价模型，流式细胞术检测发现CMC浓度梯度依赖性引起G2/M期阻滞，且该阻滞具有特异性和可逆性。体内体外实验证实CMC直接作用于微管并导致HeLa细胞微管解聚。AnnexinV/PI双染和sub-G1峰(凋亡峰)的检测结果表明CMC通过引起G2/M期阻滞导致HeLa细胞发生凋亡。 第三类化合物PhysalinB是从P.angulata分离得到的天然产物。之前的体内体外实验证实PhysalinB具有较好抗肿瘤活性，且能抑制泛素化-蛋白酶体信号通路和NF-κB信号通路，并激活NOXA导致细胞凋亡，而具体作用机制并未得到阐明。为研究其作用机制，我们从苦藏(Physalisangulata)中提取了PhysalinB，并在结肠癌HCT116细胞株上做进一步探讨。PhysalinB明显抑制HCT116细胞增殖并引起凋亡，表现出较好的抗肿瘤细胞增殖活性。PhysalinB促进自噬泡形成以及Ⅱ型LC3和p62的堆积，表明PhysalinB抑制了自噬降解环节，而进一步实验结果显示该作用是由微管组织结构被破坏进而影响自噬泡和溶酶体的共定位所引起。此外，PhysalinB引起S期和G2/M期周期阻滞、泛素化蛋白堆积、细胞以及线粒体ROS水平增加、并抑制了NF-κB信号通路。而ROS清除剂NAC有效逆转PhysalinB对一系列信号通路的影响，同时恢复细胞的增殖，表明PhysalinB通过产生线粒体ROS来发挥其抗增殖活性。 第四类化合物YM006在多株肿瘤细胞株上有明显细胞毒性并有效抑制人A549细胞裸鼠移植瘤生长。随后我们在A549细胞株上对其作用机制进行研究。细胞形态观察、PI/Hoechst33342双染实验以及AnnexinV/PI双染实验证实YM006引起细胞坏死而非凋亡。YM006引起生成大量活性氧(ROS)而没有引起ATP耗竭，同时引起线粒体膜电位(MMP)下降以及严重的溶酶体膜通透化(LMP)等坏死相关事件发生。ROS清除剂NAC有效清除YM006引起的ROS生成并逆转MMP下降、LMP发生及坏死，表明YM006导致的坏死依赖ROS的产生。RIP1抑制剂nec-1部分逆转坏死，表明YM006引起了可调控的坏死。随后实验结果表明YM006引起的ROS产生于线粒体，其抑制了细胞呼吸，但没有抑制线粒体呼吸链功能。 综上所述，本论文对四类抗肿瘤活性小分子进行了机制探讨，分别研究了L538、CMC、PhysalinB以及YM006的抗肿瘤作用机制，这为随后的进一步机制研究及结构优化提供了理论依据。