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目的：
本文旨在通过内质网(ER)应激途径探讨大黄素甲醚(Physcion)对人急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)细胞系(SUPB-15和NALM-6)凋亡的影响及其机制，并通过体内实验观察大黄素甲醚对异种移植小鼠模型的抗白血病效应，为大黄素甲醚治疗ALL提供实验依据。
方法：
1.细胞培养：采用体外细胞培养技术培养NALM-6和SUPB-15ALL细胞系。
2.实验分组：选用NALM-6和SUPB-15ALL细胞系。(1)检测大黄素甲醚不同浓度(0μM、5μM、10μM)对ALL细胞活力和线粒体功能的影响;(2)检测caspase-9特异性抑制剂Z-Lehd-FMK在大黄素甲醚诱导细胞凋亡中的作用，将实验分为大黄素甲醚干预组、大黄素甲醚+Z-Lehd-FMK干预组、空白对照组;(3)选用ER应激抑制剂Salubral检测ER应激在大黄素甲醚诱导细胞凋亡中的作用，将实验分为大黄素甲醚干预组、Salubral干预组以及Salubral+大黄素甲醚干预组、空白对照组;(4)根据CHOP沉默载体的使用，将实验分为大黄素甲醚干预组、CHOPshRNA干预组、大黄素甲醚+CHOP shRNA干预组、空白对照组;(5)使用AMPK特异性抑制剂compound C研究AMPK信号通路在大黄素甲醚诱导的ER应激中的作用，将实验分为compound C干预组、大黄素甲醚干预组、compound C+大黄素甲醚干预组、空白对照组;(6)根据AMPK siRNA的使用，将实验分为空白对照组、大黄素甲醚组、AMPK siRNA组、大黄素甲醚+AMPK siRNA组;
3.CCK8(cell counting kit-8，CCK8)：(1)检测不同干预浓度大黄素甲醚处理24h、48h和72h后对Nalm-6和SUPB-15细胞增殖抑制作用的影响情况;(2)筛选大黄素甲醚干预的最佳药物浓度及作用时间;
4.细胞凋亡：(1)通过流式细胞术和TUNEL检测大黄素甲醚不同干预浓度处理Nalm-6和SUPB-15细胞48h后的凋亡情况;(2)流式细胞术检测ER应激途径和AMPK通路抑制剂对各组细胞凋亡的影响;(3)流式细胞术检测CHOP shRNA和AMPK siRNA对Nalm-6和SUPB-15细胞凋亡的影响;
5.酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)：通过检测荧光强度评估caspase-9和caspase-12活性;
6.线粒体膜电位检测：通过JC-10膜电位检测试剂盒测量线粒体膜电位的变化;
7.干扰载体的构建：根据已发表的序列合成了靶向CHOP的shRNA寡核苷酸和AMPK siRNA;
8.细胞转染：通过Lipo3000分别对ALL细胞转染CHOP shRNA以及AMPK siRNA，48h后进行基因检测;
9.Western blot法：通过蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白(Caspase3，PATP)、线粒体相关蛋白(Caspase9，细胞色素C)、内质网应激相关蛋白(Caspase12,CHOP,GRP78,GRP94,p-PERK,PERK,ATF6,p-eIF2α,eIF2α)以及AMPK信号通路相关蛋白(p-AMPK and AMPK)的表达情况;
10.动物实验：建立小鼠异种动物移植模型，评估不同浓度大黄素甲醚对预后以及生存时间的影响。
结果：
1.大黄素甲醚呈剂量-时间依赖性方式抑制NALM-6和SupB-15的增殖活性;
2.大黄素甲醚具有明显诱导ALL细胞凋亡的作用，凋亡细胞数量和比例呈剂量依赖性方式增加;大黄素甲醚干预后，ALL细胞中caspase-3和聚ADP-核糖聚合酶(PARP)呈剂量依赖性激活;
3.大黄素甲醚可使线粒体膜电位去极化，剂量依赖性诱导线粒体功能紊乱;线粒体功能障碍可以通过激活caspase-9诱导细胞凋亡;经过caspase-9特异性抑制剂Z-Lehd-FMK处理后，能够明显消除大黄素甲醚诱导ALL细胞凋亡的作用，结果显示PHYSCION通过线粒体途径诱导细胞凋亡。
4.大黄素甲醚可促进caspase-3和PARP的表达激活内质网应激途径;用抑制剂Sal曲ral处理后，内质网应激途径被阻断，可明显减轻大黄素甲醚的促凋亡作用。相应地，大黄素甲醚对caspase-3和PARP的激活也被Salubral所阻断;CHOP基因敲除可显著抑制大黄素甲醚诱导的细胞凋亡以及caspase-3和PARP的激活;
5.大黄素甲醚可引起AMPK的磷酸化呈剂量依赖性增加;ComPound C和AMPK siRNA可明显阻断大黄素甲醚诱导的ER应激以及大黄素甲醚诱导的NALM-6和SupB-15细胞凋亡;
6.在异种移植瘤小鼠模型中，大黄素甲醚具有明显减轻肿瘤负担和延长生存期的作用。
结论：
1.大黄素甲醚诱导ALL细胞系NALM-6和SupB-15细胞凋亡，从而抑制细胞生长;
2.大黄素甲醚通过活化AMPK信号通路激活ER应激诱导ALL细胞的凋亡;
3.在ALL细胞中，大黄素甲醚在体外和体内均具有抗白血病作用，大黄素甲醚可能成为治疗ALL的一种潜在药物。
本文旨在通过内质网(ER)应激途径探讨大黄素甲醚(Physcion)对人急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)细胞系(SUPB-15和NALM-6)凋亡的影响及其机制，并通过体内实验观察大黄素甲醚对异种移植小鼠模型的抗白血病效应，为大黄素甲醚治疗ALL提供实验依据。
方法：
1.细胞培养：采用体外细胞培养技术培养NALM-6和SUPB-15ALL细胞系。
2.实验分组：选用NALM-6和SUPB-15ALL细胞系。(1)检测大黄素甲醚不同浓度(0μM、5μM、10μM)对ALL细胞活力和线粒体功能的影响;(2)检测caspase-9特异性抑制剂Z-Lehd-FMK在大黄素甲醚诱导细胞凋亡中的作用，将实验分为大黄素甲醚干预组、大黄素甲醚+Z-Lehd-FMK干预组、空白对照组;(3)选用ER应激抑制剂Salubral检测ER应激在大黄素甲醚诱导细胞凋亡中的作用，将实验分为大黄素甲醚干预组、Salubral干预组以及Salubral+大黄素甲醚干预组、空白对照组;(4)根据CHOP沉默载体的使用，将实验分为大黄素甲醚干预组、CHOPshRNA干预组、大黄素甲醚+CHOP shRNA干预组、空白对照组;(5)使用AMPK特异性抑制剂compound C研究AMPK信号通路在大黄素甲醚诱导的ER应激中的作用，将实验分为compound C干预组、大黄素甲醚干预组、compound C+大黄素甲醚干预组、空白对照组;(6)根据AMPK siRNA的使用，将实验分为空白对照组、大黄素甲醚组、AMPK siRNA组、大黄素甲醚+AMPK siRNA组;
3.CCK8(cell counting kit-8，CCK8)：(1)检测不同干预浓度大黄素甲醚处理24h、48h和72h后对Nalm-6和SUPB-15细胞增殖抑制作用的影响情况;(2)筛选大黄素甲醚干预的最佳药物浓度及作用时间;
4.细胞凋亡：(1)通过流式细胞术和TUNEL检测大黄素甲醚不同干预浓度处理Nalm-6和SUPB-15细胞48h后的凋亡情况;(2)流式细胞术检测ER应激途径和AMPK通路抑制剂对各组细胞凋亡的影响;(3)流式细胞术检测CHOP shRNA和AMPK siRNA对Nalm-6和SUPB-15细胞凋亡的影响;
5.酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)：通过检测荧光强度评估caspase-9和caspase-12活性;
6.线粒体膜电位检测：通过JC-10膜电位检测试剂盒测量线粒体膜电位的变化;
7.干扰载体的构建：根据已发表的序列合成了靶向CHOP的shRNA寡核苷酸和AMPK siRNA;
8.细胞转染：通过Lipo3000分别对ALL细胞转染CHOP shRNA以及AMPK siRNA，48h后进行基因检测;
9.Western blot法：通过蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白(Caspase3，PATP)、线粒体相关蛋白(Caspase9，细胞色素C)、内质网应激相关蛋白(Caspase12,CHOP,GRP78,GRP94,p-PERK,PERK,ATF6,p-eIF2α,eIF2α)以及AMPK信号通路相关蛋白(p-AMPK and AMPK)的表达情况;
10.动物实验：建立小鼠异种动物移植模型，评估不同浓度大黄素甲醚对预后以及生存时间的影响。
结果：
1.大黄素甲醚呈剂量-时间依赖性方式抑制NALM-6和SupB-15的增殖活性;
2.大黄素甲醚具有明显诱导ALL细胞凋亡的作用，凋亡细胞数量和比例呈剂量依赖性方式增加;大黄素甲醚干预后，ALL细胞中caspase-3和聚ADP-核糖聚合酶(PARP)呈剂量依赖性激活;
3.大黄素甲醚可使线粒体膜电位去极化，剂量依赖性诱导线粒体功能紊乱;线粒体功能障碍可以通过激活caspase-9诱导细胞凋亡;经过caspase-9特异性抑制剂Z-Lehd-FMK处理后，能够明显消除大黄素甲醚诱导ALL细胞凋亡的作用，结果显示PHYSCION通过线粒体途径诱导细胞凋亡。
4.大黄素甲醚可促进caspase-3和PARP的表达激活内质网应激途径;用抑制剂Sal曲ral处理后，内质网应激途径被阻断，可明显减轻大黄素甲醚的促凋亡作用。相应地，大黄素甲醚对caspase-3和PARP的激活也被Salubral所阻断;CHOP基因敲除可显著抑制大黄素甲醚诱导的细胞凋亡以及caspase-3和PARP的激活;
5.大黄素甲醚可引起AMPK的磷酸化呈剂量依赖性增加;ComPound C和AMPK siRNA可明显阻断大黄素甲醚诱导的ER应激以及大黄素甲醚诱导的NALM-6和SupB-15细胞凋亡;
6.在异种移植瘤小鼠模型中，大黄素甲醚具有明显减轻肿瘤负担和延长生存期的作用。
结论：
1.大黄素甲醚诱导ALL细胞系NALM-6和SupB-15细胞凋亡，从而抑制细胞生长;
2.大黄素甲醚通过活化AMPK信号通路激活ER应激诱导ALL细胞的凋亡;
3.在ALL细胞中，大黄素甲醚在体外和体内均具有抗白血病作用，大黄素甲醚可能成为治疗ALL的一种潜在药物。