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弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是异质性极大的恶性淋巴瘤类型,近年来,对弥漫性大B细胞淋巴瘤病理亚型和基于利妥昔单抗的化学免疫治疗的研究取得较大进展,但仍有约35%~40%的患者总体疗效不甚理想或者较快出现耐药。对该部分患者亟待进一步明确其发病及耐药机制,更有针对性地进行靶向治疗以提高临床疗效。微小RNA(micro RNA,miRNA或miR)通过调节细胞分化、增殖、凋亡等基本过程参与包括DLBCL在内的肿瘤发生,在肿瘤诊治、预后判断中具有重要作用。在我们的前期研究中,我们推测miR-181a/b及miR-195的表达可能在DLBCL发病,进展及耐药机制中发挥重要作用。因而,本论文研究了在弥漫性大B细胞淋巴瘤中miR-181a/b及miR-195表达的临床意义及作用机制。第一部分miR-181a通过调控CARD11抑制ABC型弥漫性大B细胞淋巴瘤进展的机制研究背景:活化B细胞(ABC)型弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)常伴NF-κB激活,进而介导细胞增殖耐药,治疗反应差。前期研究发现ABC型弥漫性大B细胞淋巴瘤存在miR-181a低表达,过表达miR-181a可能通过抑制CARD11等关键基因调节NF-κB通路,提高弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞对免疫化疗的敏感性。方法:荧光定量PCR检测活化B细胞样型弥漫性大B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)中miR-181a的表达水平;生物信息学方法候选出可能受miR-181a调控,且在ABC-DLBCL显著高表达的抗凋亡基因;构建双荧光素酶报告基因载体,分别构建含有靶基因CARD11 3’UTR区的质粒,与miR-181a、anti-miR-181a inhibitor、control mimic共转染ABC-DLBCL细胞株,进行荧光素酶实验鉴定miR-181a的靶分子;采用Western Blot于蛋白水平检测靶基因CARD11在过表达miR-181a前后的表达变化,流式Annexin/PI双染法检测细胞凋亡率的改变;构建SCID小鼠移植瘤模型来研究miR-181a对ABC-DLBCL肿瘤发生发展的影响。结果:活化B细胞样型弥漫性大B细胞淋巴瘤较生发中心B细胞样型弥漫性大B细胞淋巴瘤中miR-181a的表达量显著下降;双荧光素酶报告实验及western Blot实验显示miR-181a对CARD11有明显的抑制作用;流式Annexin/PI双染法显示miR-181a过表达组早期凋亡和晚期凋亡率均高于miR-181a+CARD11转染组及转染对照序列组;SCID小鼠成瘤实验显示注射miR-181a后较对照组或注射miR-181a+CARD11组的肿瘤显著缩小,过表达miR-181a通过靶向抑制CARD11可显著抑制ABC型DLBCL肿瘤形成。结论:过表达miR-181a靶向抑制CARD11可显著抑制ABC型弥漫性大B细胞淋巴瘤肿瘤形成。第二部分miR-181b在弥漫性大B细胞淋巴瘤中表达及功能研究背景:研究证实多种恶性肿瘤中的miR-181b的表达与肿瘤细胞侵袭性之关系十分密切,以此推测miR-181b的表达与肿瘤的不良预后存在关系。方法:选择2010年3月到2012年3月期间124例弥漫性大B细胞淋巴瘤患者的淋巴组织样本作为观察组,另选择64例经检查确定为排除淋巴瘤病变的患者正常淋巴组织作为对照组。检测两组样本中miR-181b的表达水平,并结合临床特征进行分析生存情况。结果:观察组肿瘤组织中miR-181b的相对表达量显著高于对照组(P<0.05)。Ann Arbor分期和IPI评分与患者淋巴组织中miR-181b的相对表达量正性相关(P<0.05)。miR-181b低表达组患者5年生存率显著高于高表达组患者(P<0.05)。结论:miR-181b在不同临床分期和预后的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者淋巴组织中表达存在差异,它有可能成为未来对弥漫性大B细胞淋巴瘤诊断和预后监测的有效指标。第三部分miR-195过表达靶向调控PD-L1抑制弥漫性大B细胞淋巴瘤免疫逃逸背景:弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是严重危害人类健康的恶性肿瘤,而免疫系统紊乱是其发生及发展的重要因素,然而目前分子机制尚未阐明。方法:采用Real-time PCR检测miR-195及PD-L1m RNA的表达,Western blot检测PD-L1的蛋白表达,采用流式细胞术检测外周血中PD-1+T细胞的比例。采用ELISA检测IFN-γ,TNF-α和IL-10等细胞因子的分泌,使用Lipofectamine TM2000将miR-195类似物及抑制物转染入细胞。应用荧光素酶基因报告实验检测荧光素酶活性。结果:DLBCL患者病理组织中miR-195表达显著下降,而PD-L1m RNA水平上调。而外周血中PD-1+T细胞的比例显著增加。弥漫大B细胞淋巴瘤患者中miR-195的表达与PD-L1的表达为负相关性。miR-195类似物转染显著提升了miR-195的表达,却降低了PD-L1的表达。miR-195过表达抑制了PD-L1的表达。此外,在T细胞和OCI-Ly-10细胞共培养模型中miR-195过表达显著促进了IFN-γ和TNF-α分泌,但降低了IL-10的分泌和PD-1+T细胞的比例。转染miR-195类似物的HEK293T细胞显著降低了WT细胞荧光素酶的活性,抑制了PD-L1的表达,转染miR-195抑制物的HEK293T细胞显著提升了WT细胞荧光素酶的活性,促进了PD-L1的表达。在T细胞和OCI-Ly-10细胞共培养模型中miR-195过表达通过抑制PD-L1的表达,促进IFN-γ,TNF-α的分泌,但降低了IL-10的分泌和PD-1+T细胞的比例。结论:miR-195与PD-L1可能参与了弥漫性大B细胞淋巴瘤的发病机制。PD-L1为miR-195供应下游基因。miR-195介导了T细胞功能。miR-195靶向调节PD-L1的表达。miR-195靶向调控PD-L1调节了T细胞的功能。总之,miR-195过表达通过抑制了PD-L1的表达提升弥漫性大B细胞淋巴瘤患者免疫反应。