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雄性生殖干细胞(male Germline Stem Cells,mGSCs)是定位于雄性动物睾丸中的曲细精管基底膜上的成体干细胞。mGSCs不仅能够通过自我更新来维持自身群体数量的稳定,还可以通过定向分化产生精子,是唯一一种能够通过自然生殖过程将雄性动物的遗传信息传递到下一代的成体干细胞。PLZF是一种高度保守的多功能转录调控因子,其表达具有严格的组织特异性和时序特异性,参与机体的发育、分化等多种重要的生物学过程。近年来,PLZF作为非常重要的转录因子,已引起人们的广泛关注。PLZF表达于未分化的mGSCs,对其多能性的维持、自我更新和分化的平衡以及雄性个体的生育能力维持等具有重要的调控作用,是被广泛认可的mGSCs的标志基因。目前,虽然对PLZF调控mGSCs自我更新和分化的作用及作用机制的探索已经取得了一些进展,但这些研究都是在小鼠等模式动物中取得的。PLZF对山羊等家畜大动物mGSCs的作用及作用机制却知之甚少。本研究拟在已有基础上,探索PLZF对奶山羊mGSCs生物学特性的的影响,以进一步了解其对精子发生过程的调节机制。本实验通过构建PLZF超表达和干扰慢病毒载体,转导奶山羊mGSCs,并筛选得到了稳定超表达和干扰PLZF的奶山羊mGSCs细胞株。并通过免疫荧光染色,qPCR,Western blot,EdU染色,流式细胞检测等技术手段检测了PLZF对奶山羊mGSCs多能性、自我更新、增殖、分化和凋亡等生物学特性的影响。1.PLZF超表达载体及干扰载体的构建和稳转细胞株的筛选我们构建得到了PLZF慢病毒超表达载体pPLZF-CDH和PLZF慢病毒干扰载体pshPLZF。然后将慢病毒载体包装病毒并转导奶山羊mGSC,通过筛选、鉴定得到了超表达PLZF的稳转细胞株mGSCs-oePLZF及其对照细胞株mGSCs-pCDH,干扰PLZF的稳转细胞株mGSCs-pshPLZF及其对照细胞株mGSCs-pSIH。2.PLZF促进奶山羊mGSCs维持其自我更新和多能性并抑制其分化通过免疫荧光染色、qPCR和Western blot检测,研究发现GFRα1、Vasa、CD49f、CD90、Oct4、Etv5等与mGSCs自我更新和多能性相关的基因表达显著上调,而mGSCs的分化标志基因c-Kit表达水平显著下调。另外我们通过qPCR检测发现Tet1表达水平显著下调,同时Dnmt3a表达水平显著上调,说明PLZF可能促进奶山羊mGSCs的DNA甲基化修饰。3.PLZF抑制奶山羊mGSCs增殖,促进其凋亡我们通过测定细胞生长曲线、CCK8检测、EdU染色、流式细胞周期检测、免疫荧光染色、qPCR、Western blot等实验方法,发现超表达PLZF的奶山羊mGSCs细胞增殖速度变慢、细胞周期在G0/G1期发生阻滞,细胞凋亡相关基因表达上调。通过细胞移植实验发现,移植PLZF超表达稳转细胞的白消安模型小鼠睾丸要明显比对侧移植对照细胞的睾丸小,且曲细精管内形成的细胞克隆也明显比对照组差;相应的,移植PLZF干扰稳转细胞的睾丸明显比对照组大,曲细精管内形成的细胞克隆也比对照组好。