论文部分内容阅读
铁是哺乳动物和几乎所有病原菌生长必不可少的微量元素，因此机体感染情况下，宿主和病原菌对铁的利用存在相互竞争关系。本研究旨在通过建立断奶仔猪大肠杆菌K88攻毒模型，研究感染条件下机体限制病原菌对铁利用的营养免疫策略以及病原菌规避机体免疫反应的手段，为铁在生猪生产上尤其是感染条件下的合理应用提供一定的理论基础。 试验一:大肠杆菌K88攻毒对仔猪铁代谢的影响 本试验以断奶仔猪为研究对象，比较了大肠杆菌K88攻毒对仔猪生长性能、肠道大肠杆菌菌落数量、肠道组织形态及肠道炎症因子表达的影响。结果显示:大肠杆菌K88攻毒①显著降低了仔猪的平均日增重和日采食量(p＜0.05);②显著提高了仔猪结肠和盲肠内容物中大肠杆菌数量(p＜0.05);③降低了十二指肠绒毛长度，绒毛边界不清晰，上皮间杯状细胞分泌增加;对空肠绒毛形态造成了较严重的影响，绒毛断裂破损明显;④显著提高了空肠TNF-α，回肠IL-1β、TNF-α的基因表达水平(p＜0.05)，同时不同程度地提高了空肠IL-1β、IL-6、IFN-γ和回肠IL-6、IFN-γ的基因表达水平(p＞0.05)。上述结果表明仔猪大肠杆菌K88感染模型建立成功。 进一步探讨了大肠杆菌K88感染对仔猪铁代谢的影响。首先研究了感染对肝脏、脾脏、十二指肠铁代谢相关基因和蛋白表达的影响。结果显示:①攻毒显著提高了肝脏hepcidin及其上游基因HJV的基因表达水平(p＜0.05);显著降低了肝脏和脾脏hepcidin的受体FPN的基因和蛋白表达水平(p＜0.05)，而对十二指肠FPN的基因和蛋白表达水平没有显著影响(p＞0.05);②攻毒显著提高了肝脏、脾脏转铁蛋白受体基因TFRC(TfR1)的基因表达水平(p＜0.05);③攻毒显著提高了肝脏、十二指肠铁储存相关基因ferritin-H的基因和蛋白表达水平(p＜0.05)，而对脾脏ferritin-H的基因和蛋白表达的提高水平差异不显著(p＞0.05);④攻毒显著降低了十二指肠铁吸收基因DMT1的表达水平(p＜0.05)。 肝脏、脾脏和十二指肠铁代谢相关基因和蛋白的变化直接影响铁在机体的再分配，因此我们接下来检测了肝脏、脾脏非血红素铁和血液中铁的含量。结果显示:攻毒①显著提高了肝脏非血红素铁含量(p＜0.05)，而对脾脏非血红素铁含量没有显著影响(p＞0.05);②显著降低了血清总铁结合力、转铁蛋白饱和度(p＜0.05)，极显著降低了血清铁含量(p＜0.01)。 以上结果表明:仔猪染菌显著提高了铁调素hepcidin的表达水平，从而降低了其受体蛋白FPN水平，使细胞铁输出造成障碍，引起组织中铁储存相关基因ferritin-H表达增加。同时，染菌使十二指肠铁吸收基因DMT1的表达受抑，最终使得血铁含量减少，使仔猪表现出一定的缺铁倾向。 试验二:铁对细菌铁代谢的影响及Lcn2在抗感染中的作用 细菌感染导致的血铁含量降低，使得侵入机体内的细菌铁的来源减少，势必会影响细菌本身的铁代谢。因此本试验首先通过体外试验，研究了低铁对细菌铁代谢相关基因表达的影响以及对细菌合成铁载体能力的影响。基因试验结果表明:与对照组、50μM Fe3+(FeCl3)处理组和100μM Fe3+(FeCl3)处理组相比，低铁组（铁鳌合剂处理组）都极显著提高了细菌铁载体合成相关基因entD、铁载体输出相关基因entS、铁载体受体基因fepA的表达(p＜0.01);极显著降低了细菌铁储存相关蛋白bfr和ftnA的基因表达水平(p＜0.01)。铁载体试验表明:大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50013在无铁情况下都产生了铁载体，而在10μM Fe3+(FeCl3)和40μM Fe3+(FeCl3)铁浓度条件下都几乎不产生铁载体。 人和小鼠上的研究显示，机体存在可以与细菌铁载体结合的分泌型蛋白:脂质运载蛋白2(Lcn2)，它与铁载体结合可以抑制细菌增殖，因此我们接下来探究了Lcn2在仔猪大肠杆菌K88感染过程中的作用。体内试验结果表明:Lcn2在猪大多数组织中都有表达，其中在肾脏、脾脏、胸腺中高表达，在肝脏、空肠、结肠中低表达;在大肠杆菌K88攻毒情况下，肝脏中Lcn2基因表达水平上升了30倍左右(p＜0.05)，胸腺、空肠、脾脏Lcn2表达水平也有不同程度的提高(p＜0.05)。体外细胞试验结果表明:大肠杆菌K88和鼠伤寒沙门氏菌CMCC50013感染均会上调猪小肠上皮细胞IPEC-1中Lcn2的表达(p＜0.05)，且内源性诱导的Lcn2表现出了一定的抑菌活性;外源性Lcn2同样能抑制大肠杆菌K88(p＜0.05)和鼠伤寒沙门氏菌CMCC50013(p＜0.01)在猪肺泡巨噬细胞3D4/2中的增殖。 以上结果表明:低铁环境能显著增加细菌铁载体的合成与输出;而Lcn2能与细菌铁载体结合，通过降低其获铁能力，减缓细菌的生长。 综上所述，仔猪在染菌情况下表现出了一定的缺铁倾向，通过扣押细菌所需要的铁，影响细菌的生长;同时机体又提高Lcn2表达，通过其结合细菌在低铁环境中分泌的铁载体，限制细菌铁获取，影响细菌的增殖。