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目的制备纯粒径的纳米微泡,将带有HER2分子配体的Affibody与纳米微泡偶联,合成对乳腺癌HER2分子具有特异靶向性的纳米级微泡超声造影剂“纳米微泡-Affibody”,并通过体外、体内实验验证其对乳腺癌HER2分子的特异靶向性,进一步通过分子靶向超声造影无创估测HER2分子在乳腺癌中的表达水平。另外探讨制备携载有IR780的多功能靶向纳米微泡,为肿瘤的分子靶向超声造影诊断和治疗提供新的思路。方法1.将14mg DPPC和DSPE-PEG2000(biotin)按一定比例混合置于25m l旋蒸瓶成膜,联合机械振荡法,最终制备出纯粒径的纳米微泡。使用荧光显微镜、扫描电镜对纳米微泡的形态进行观察,粒度/电位分析仪进一步检测其粒径分布情况和表面电位,MTT法检测纳米微泡对细胞的毒性反应。2.利用“生物素-亲和素”法,将专门靶向乳腺癌HER2分子的微小蛋白“抗-HER2 Affibody”偶联于纳米微泡表面,连接好的“纳米微泡-Affibody”分别与多种HER2(+)及HER2(-)肿瘤细胞共孵育,倒置荧光显微镜观察其体外靶向性;流式细胞仪分析“纳米微泡-Affibody”与HER2(+)乳腺癌细胞的靶向结合率情况;粒度/电位分析仪分析“纳米微泡-Affibody”在模拟体内温度下的稳定性情况;自制橡胶手套装置检测“纳米微泡-Affibody”在体外的超声造影成像效果。3.建立荷瘤裸鼠模型,经尾静脉注射“纳米微泡-Affibody”,超声诊断仪观察其分子靶向超声增强显影效果。小动物荧光成像系统观察“纳米微泡-Affibody”在体内肿瘤及各重要脏器的分布代谢情况。肿瘤病理切片激光共聚焦显微镜观察“纳米微泡-Affibody”在肿瘤中的靶向分布情况。4.在纳米微泡制作过程中,将微量的IR780混合入DPPC和DSPE-PEG2000(biotin)中成膜,直接制备出多功能纳米微泡。激光共聚焦电子显微镜、透射电镜及粒度/电位分析仪对其各项特性进行检测。体外培养多种肿瘤细胞,以大鼠心肌细胞作为阴性对照,体外观察该多功能纳米微泡对肿瘤细胞的特异靶向性及体外超声造影成像效果。结果1.通过控制脂质膜厚度能制备出纯粒径纳米微泡:478.2±29.7 nm,其在扫描电镜下为均匀分散分布的纳米级空洞,稳定性良好,对细胞无毒性。2.合成”纳米微泡-Affibody“分子靶向超声造影剂。体外实验证实其对HER2(+)肿瘤细胞均有特异靶向性,对HER2(-)肿瘤细胞无靶向性,同时也证实了纳米微泡对HER2(+)肿瘤细胞无靶向性。3.体内超声造影结果表明,“纳米微泡-Affibody”虽然造影持续时间较短,但达峰时间快,且增强显影强度明显高于声诺维和纳米微泡(104.539±6.42 d B vs.79.451±8.05 d B,P<0.05;104.539±6.42 d B vs.70.753±10.33 d B,P<0.05)。小动物荧光成像系统证实,“纳米微泡-Affibody”组的肿瘤在3min时荧光摄取率(4.79e07±210797.3)明显高于纳米微泡组(4.27e07±78270.26)(P<0.05),到30min时荧光摄取率虽较前略有下降,却依然高于纳米微泡组(5.32e07±347809.7 vs.2.13e07±122119.9,P<0.05)。肿瘤病理切片显示,“纳米微泡-Affibody”能更多地穿过肿瘤血管壁到达组织间隙和肿瘤细胞表面。4.新合成的多功能纳米微泡,粒径分布大小约为:552.7±55.0 nm,生物相容性好,对人乳腺癌细胞BT-474和MDA-MB-231都具有特异靶向性,而对大鼠心肌细胞无靶向性。结论通过控制磷脂膜的厚度,可以直接制备出纯纳米粒径的微泡,从而避免了从微/纳泡混悬液分离纳米微泡的繁琐步骤。新合成的分子靶向超声造影剂“纳米微泡-Affibody”,能在体内、外特异性靶向HER2(+)乳腺癌肿瘤及细胞。“纳米微泡-Affibod y”在体内形成的分子靶向显影为无创地判断HER2分子在乳腺癌中的表达状态提供了依据。同时,成功制备了具有近红外荧光成像、超声造影成像及肿瘤靶向性的多功能纳米微泡,更为肿瘤的分子靶向超声造影提供了新的思路。