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研究背景缺血性心脏病（Ischemia Heart Disease, IHD）引发的心力衰竭（Heart Failure, HF）呈逐年上升趋势。患者如果没能得到及时有效的治疗，心肌细胞则会出现大范围地变性、坏死，从而引起各种并发症和严重后果的发生，严重威胁着人类的生命和生活质量。一般认为，心肌细胞是终末细胞，损伤后不能再生，即使能够再生，每年更新率不到1%。一旦出现心肌组织大范围受损，目前的药物治疗只能控制症状，延缓病情的恶化，并不能修复和根治终末期心衰。心脏移植是一种有效的治疗方法，但存在供体来源有限，免疫排斥，费用昂贵等一系列问题，不能广泛应用于临床，因此寻找新的治疗方法一直是研究人员追寻的目标。细胞移植成为近年来治疗IHD的热点，并飞速发展。干细胞诱导分化并用于治疗心肌梗死的临床研究正在如火如荼的进行中，但其分化率较低仍是目前需要解决的主要问题。研究目的1.探讨体外分离、培养和纯化BMMSCs的方法并改进技术。2.研究PFT-α和BMP-2联合诱导BMMSCs向心肌样细胞分化的作用。研究方法1. BMMSCs体外分离、培养及鉴定：冲洗大鼠四肢长骨得骨髓冲洗液，采用差速贴壁法和密度梯度离心法相结合的方法分离出BMMSCs，通过传代培养来纯化细胞。流式细胞计数法测定细胞表面阴性抗原CD45和阳性抗原CD44、CD29表达情况。显微镜下动态观察细胞的生长状况，记录形态并拍照。2. PFT-α和BMP-2联合诱导BMMSCs向心肌样细胞分化作用的测定：选取第4代BMMSCs进行诱导分化。实验分组如下：Control组（完全培养液）、PFT-α组（20μmol/L）、BMP-2组（10μg/L）、PFT-α+BMP-2组（PFT-α：20μmol/L，BMP-2：10μg/L）。前3组诱导24h后换完全培养液，PFT-α+BMP-2组诱导48h后换完全培养液。诱导结束即刻用流式细胞计数法测定细胞凋亡情况。免疫荧光染色法和蛋白免疫印迹法测定细胞Cx43、cTn I表达情况；流式细胞计数法测定各组心肌样细胞的分化。研究结果1.体外培养BMMSCs的形态学特征及鉴定：即刻分离的原代细胞体积小，透亮，折光性强；3d时细胞贴壁，形态多样，表现为椭圆形、星形、梭形、不规则形等；1w时细胞排列规则，呈集落样成长；细胞传代后的体积增大，表现为长梭形，核浆比增大。流式细胞计数法测定BMMSCs表面抗原阳性率，结果分别为：CD29（93.77±2.440）%；CD44（93.03±1.10）%；CD45（1.97±0.74）%。2. PFT-α和BMP-2联合诱导BMMSCs向心肌样细胞分化作用：诱导后细胞凋亡结果：Control组、PFT-α组、BMP-2组和PFT-α+BMP-2组Q3分别为（89.34±3.18）%、（55.55±5.32）%、（80.44±4.34）%、（70.33±2.61）%。BMP-2组与Control组比较无统计学差异（P≥0.05），其余各组之间均存在统计学差异（P＜0.01）。Western Blot测定结果，Cx43表达：1w时，Control组、PFT-α组、BMP-2组和PFT-α+BMP-2组灰度值比值分别为（0.153±0.068）、（0.313±0.036）、（0.263±0.024）、（0.394±0.054）；Control组低于诱导组（P＜0.01），PFT-α+BMP-2组高于其它实验组（P＜0.05），PFT-α组和BMP-2组比较无统计学差异（P≥0.05）。4w时，Control组、PFT-α组、BMP-2组和PFT-α+BMP-2组灰度值比值分别为（0.342±0.038）（、0.763±0.053）、（0.627±0.083）、（1.065±0.048）；Control组低于诱导组（P＜0.01），PFT-α+BMP-2组高于其它实验组（P＜0.05）。cTn I表达：1w时，Control组、PFT-α组、BMP-2组和PFT-α+BMP-2组灰度值比值分别为（0.034±0.001）、（0.263±0.026）、（0.193±0.033）、（0.394±0.045）；Control组低于诱导组（P＜0.01），PFT-α+BMP-2组高于其它实验组（P＜0.05）。4w时，Control组、PFT-α组、BMP-2组和PFT-α+BMP-2组灰度值比值分别为（0.072±0.014）、（0.646±0.043）、（0.546±0.029）、（0.877±0.037）；Control组低于诱导组（P＜0.01），PFT-α+BMP-2组高于其它实验组（P＜0.05）。免疫荧光染色鉴定结果：Cx43表达：1w时，Control组无表达，诱导组微弱表达；4w时，Control组微弱表达，诱导组表达增强。cTn I表达：1w时，Control组无表达，诱导组微弱表达；4w时，Control组仍无表达，诱导组表达增强。分化率结果：Control组、PFT-α组、BMP-2组和PFT-α+BMP-2组分化率分别为（2.04±1.63）%、（26.96±1.90）%、（16.53±2.63）%、（38.48±2.44）%；Control组低于诱导组（P＜0.01），PFT-α+BMP-2组高于其他实验组（P＜0.01）。研究结论1.联合差速贴壁法和密度梯度离心法能够获得大量BMMSCs，通过传代能够得到纯度较高的BMMSCs。2. PFT-α联合BMP-2诱导BMMSCs可使其向心肌样细胞分化，并表现出与正常心肌细胞类似的生物学特性，其细胞分化率明显高于PFT-α或BMP-2单独诱导。PFT-α联合BMP-2诱导BMMMSCs后细胞凋亡率低，毒性小，是一种安全高效的定向诱导方法。