论文部分内容阅读
研究目的:二甲基二硫代氨基甲酸锌(Ziram;福美锌;CAS#137-30-4)是二硫代氨基甲酸盐类的一个成员.福美锌在农业上广泛用作杀菌剂,在橡胶工业中用作硫化促进剂.我们的前期研究也表明,福美锌对大鼠睾丸间质细胞有明显的损伤作用.然而,针对福美锌对睾丸间质干细胞的毒性作用及分子机制尚未清楚.本研究的目的就是为了探究在低剂量福美锌暴露下的成年雄性大鼠,其睾丸间质干细胞的分化是否受到影响,并且分析其影响的分子机制.我们主要研究福美锌对睾丸间质干细胞阶段的毒性作用,研究分为体内和体外两部分,我们使用了乙烷二甲烷磺酸盐(EDS)诱导的睾丸间质细胞再生模型和体外SLC分化模型模拟青春期发育的睾丸间质细胞,以检查福美锌在大鼠睾丸间质干细胞发育中的作用.睾丸间质细胞再生在EDS处理后第28天从睾丸间质干细胞分化幼睾丸间质细胞,本项目针对福美锌对睾丸间质细胞发育过程的干扰进行研究. 研究方法:体内研究,采用56天雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只,使用75mg/kg的EDS单次腹腔注射彻底清除睾丸间质细胞后,随机分成三组:0(对照组)、5、50nmol/睾丸的福美锌,每组8只.EDS后第14天开始每日进行睾丸内注射(50μl)生理盐水(对照)或福美锌,持续注射14天,在EDS后第28天处死大鼠,取血清,用化学发光法检测血清睾酮水平,用ELISA法检测血清FSH、LH水平.取睾丸,一只睾丸提RNA进行实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)检测睾丸间质细胞基因(Lhcgr、Scarb1、Star、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd3b1、Hsd11b1、Hsd17b3、Insl3、Srd5a1)和支持细胞基因(Fshr和Dhh)表达水平,匀浆进行Western免疫印迹法(WB)检测它们的蛋白(LHCGR、SCARB1、STAR、CYP11A1、CYP17A1、HSD11B1、HSD17B3、FSHR、DHH)表达量.另一只睾丸Bouin液固定进行免疫组织化学染色及免疫荧光化学检测.由于EDS处理后28天后的大鼠睾丸间质细胞处于幼睾丸间质细胞阶段,该时期的睾丸间质细胞中表达量较高的是HSD11B11和CYP11A1两个蛋白,因此免疫组织化学染色选择使用这两个抗体进行阳性细胞染色,并对每组大鼠睾丸中的阳性睾丸间质细胞进行计数及光密度定量测定HSD11B11和CYP11A1水平.免疫荧光化学染色使用线粒体的CYP11A1特异染色睾丸间质细胞和增殖细胞核抗原(PCNA)特异性染色细胞核并用DAPI对所有细胞核进行对比染色,增殖睾丸间质细胞进行计数. 体外实验,采用EDS清除睾丸间质细胞后的大鼠睾丸,分离曲细精管,用含黄体生成素(luteinizinghormone,LH)和锂离子(Li)睾丸间质干细胞分化的诱导培养基诱导睾丸间质干细胞分化为成年睾丸间质细胞并产生睾酮,其间给予不同剂量的福美锌(0、5、50、500nM)处理,通过化学发光法检测培养基中的睾酮水平,qPCR方法检测类固醇合成相关基因的表达水平和WB法检测其蛋白表达水平. 研究结果:体内实验表明,福美锌在EDS后28天不影响大鼠体重,但它降低了大鼠血清睾酮水平和睾丸间质细胞的类固醇生成相关基因(Lhcgr、Cyp11a1、Cyp17a1、Hsd11b1)的表达,也降低支持细胞的基因(Fshr和Dhh)表达.WB结果显示福美锌体内降低了上述相关蛋白表达水平,提示福美锌可能通过下调睾丸间质细胞的类固醇合成酶相关基因抑制类固醇合成对睾丸间质干细胞的发育起到抑制作用.免疫组织化学染色(CYP11A1和HSD11B1)发现睾丸间质细胞的数目与福美锌暴露剂量有剂量依赖性下降的趋势,但无明显的统计学差异.PCNA(增殖细胞核抗原)和CYP11A1(睾丸间质细胞标记物)的双重染色也显示,睾丸间质细胞数目没有明显变化.这说明睾丸间质细胞的类固醇合成酶相关基因和蛋白的下调与睾丸间质细胞的数量变化没有直接的联系.体外研究表明,福美锌降低了培养基睾酮水平和类固醇生成相关基因(Lhcgr、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd11b1)表达水平. 结论：我们的研究结果证实暴露福美锌通过抑制睾丸间质细胞类固醇合成基因Lhcgr、Cyp11a1、Cyp17a1和Hsd11b1来引起睾丸间质细胞的分化障碍。