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[背景]
肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。我国每年新确诊的肺癌患者超过70万，死亡的肺癌患者超过60万，而非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的85%。吉非替尼是临床上广泛用于治疗晚期NSCLC的表皮生长因子酪氨酸激酶受体抑制剂(EGFR-TKI)。EGFR-TKIs能够显著延长约80%携带EGFR活性突变的NSCLC患者的无进展生存期(PFS)，但几乎所有NSCLC患者最终均会产生EGFR-TKIs继发性耐药。已有的研究表明，EGFR-TKIs的耐药机制主要包括：EGFR二次突变(T790M)、EGFR扩增、MET扩增、上皮间质转化(EMT)、肝细胞因子过表达等，但仍有30%的耐药机制未知。成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)是4型受体酪氨酸激酶家族中的一员，该家族包含4个高度保守的成员，分别为FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。FGFR1功能的获得与多种恶性肿瘤相关。FGFR1的构成性激活主要通过三种机制发生：基因扩增、易位或激活突变。已有的研究表明抑制FGFR1的活性能够增强阿法替尼或贝伐单抗的治疗效果，我们的前期研究发现FGFR1在吉非替尼耐药的PC9/GR细胞中表达水平显著升高，但其发挥作用的机制尚不清楚。因此，本实验旨在探讨NSCLC中FGFR1介导EGFR-TKIs继发性耐药的机制。
[目的]
证实FGFR1过表达导致NSCLC细胞对吉非替尼耐药；明确FGFR1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路导致NSCLC细胞对吉非替尼耐药。
[方法和结果]
1.我们通过用低剂量吉非替尼反复诱导PC9细胞构建耐药细胞株PC9/GR然后通过高通量测序筛选出表达量出现显著改变的基因，通过qRT-PCR、westernblot及ICC实验进行验证。通过平板克隆形成实验、CCK-8实验和transwell实验证实PC9/GR细胞的增殖和迁移能力显著增强。
2.我们用FGFR1的抑制剂PD173074处理PC9细胞，通过westernblot和ICC实验证实FGFR1的表达水平不受影响；通过平板克隆形成实验、CCK-8实验和transwell实验证实抑制FGFR1活性能够显著降低PC9细胞的增殖和迁移能力；通过流式细胞术证实抑制FGFR1活性能够显著降低PC9细胞的抗凋亡能力。
3.我们通过westernblot和ICC实验证实PC9/GR细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路被过度激活。我们使用小干扰RNA在PC9细胞中敲低FGFR1，通过westernblot和ICC实验证实PI3K/AKT/mTOR信号通路活性被显著抑制；通过pcDNA3.1-FGFR1在PC9细胞中过表达FGFR1，通过westernblot和ICC实验证实PI3K/AKT/mTOR信号被过度激活。
4.我们使用mTOR的抑制剂雷帕霉素处理PC9细胞，通过CCK-8实验和平板克隆形成实验证实抑制mTOR的活性能够显著抑制PC9细胞的增殖能力；通过流式细胞术证实抑制mTOR的活性能够显著降低PC9细胞的抗凋亡能力。
5.我们通过IHC实验证实FGFR1、磷酸化AKT和磷酸化mTOR在NSCLC组织中的表达水平显著高于它们在癌旁组织中的表达水平，且FGFR1与磷酸化AKT及磷酸化mTOR的表达水平呈显著正相关，生存曲线分析结果显示FGFR1高表达的NSCLC患者预后较差。
[结论]
FGFR1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路介导NSCLC细胞对吉非替尼耐药，且FGFR1高表达与NSCLC患者预后较差相关。
肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤。我国每年新确诊的肺癌患者超过70万，死亡的肺癌患者超过60万，而非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的85%。吉非替尼是临床上广泛用于治疗晚期NSCLC的表皮生长因子酪氨酸激酶受体抑制剂(EGFR-TKI)。EGFR-TKIs能够显著延长约80%携带EGFR活性突变的NSCLC患者的无进展生存期(PFS)，但几乎所有NSCLC患者最终均会产生EGFR-TKIs继发性耐药。已有的研究表明，EGFR-TKIs的耐药机制主要包括：EGFR二次突变(T790M)、EGFR扩增、MET扩增、上皮间质转化(EMT)、肝细胞因子过表达等，但仍有30%的耐药机制未知。成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)是4型受体酪氨酸激酶家族中的一员，该家族包含4个高度保守的成员，分别为FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4。FGFR1功能的获得与多种恶性肿瘤相关。FGFR1的构成性激活主要通过三种机制发生：基因扩增、易位或激活突变。已有的研究表明抑制FGFR1的活性能够增强阿法替尼或贝伐单抗的治疗效果，我们的前期研究发现FGFR1在吉非替尼耐药的PC9/GR细胞中表达水平显著升高，但其发挥作用的机制尚不清楚。因此，本实验旨在探讨NSCLC中FGFR1介导EGFR-TKIs继发性耐药的机制。
[目的]
证实FGFR1过表达导致NSCLC细胞对吉非替尼耐药；明确FGFR1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路导致NSCLC细胞对吉非替尼耐药。
[方法和结果]
1.我们通过用低剂量吉非替尼反复诱导PC9细胞构建耐药细胞株PC9/GR然后通过高通量测序筛选出表达量出现显著改变的基因，通过qRT-PCR、westernblot及ICC实验进行验证。通过平板克隆形成实验、CCK-8实验和transwell实验证实PC9/GR细胞的增殖和迁移能力显著增强。
2.我们用FGFR1的抑制剂PD173074处理PC9细胞，通过westernblot和ICC实验证实FGFR1的表达水平不受影响；通过平板克隆形成实验、CCK-8实验和transwell实验证实抑制FGFR1活性能够显著降低PC9细胞的增殖和迁移能力；通过流式细胞术证实抑制FGFR1活性能够显著降低PC9细胞的抗凋亡能力。
3.我们通过westernblot和ICC实验证实PC9/GR细胞中PI3K/AKT/mTOR信号通路被过度激活。我们使用小干扰RNA在PC9细胞中敲低FGFR1，通过westernblot和ICC实验证实PI3K/AKT/mTOR信号通路活性被显著抑制；通过pcDNA3.1-FGFR1在PC9细胞中过表达FGFR1，通过westernblot和ICC实验证实PI3K/AKT/mTOR信号被过度激活。
4.我们使用mTOR的抑制剂雷帕霉素处理PC9细胞，通过CCK-8实验和平板克隆形成实验证实抑制mTOR的活性能够显著抑制PC9细胞的增殖能力；通过流式细胞术证实抑制mTOR的活性能够显著降低PC9细胞的抗凋亡能力。
5.我们通过IHC实验证实FGFR1、磷酸化AKT和磷酸化mTOR在NSCLC组织中的表达水平显著高于它们在癌旁组织中的表达水平，且FGFR1与磷酸化AKT及磷酸化mTOR的表达水平呈显著正相关，生存曲线分析结果显示FGFR1高表达的NSCLC患者预后较差。
[结论]
FGFR1通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路介导NSCLC细胞对吉非替尼耐药，且FGFR1高表达与NSCLC患者预后较差相关。