论文部分内容阅读
异柠檬酸脱氢酶(IDH)是一大类酶家族，该酶催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸，在生物的能量产生和生物合成代谢中起着非常重要的作用。真核生物中以NADP为辅酶的异柠檬酸脱氢酶(NADP-IDH)具有很多重要的生物功能，但其动力学机制和活性调节机理目前还不清楚。我们以结构生物学为研究手段，结合生物化学和分子生物学的方法来研究人源细胞质NADP-IDH(HclDH)的动力学机制和活性调节机理。已得到该酶不同形式(野生型和突变体)及其相关复合物的蛋白质晶体，通过分析已有的结构，进行了氨基酸点突变。Ser<94>对应于EclDH上发生可逆磷酸化调节酶活性的位点Ser<113>，而Asp<279>可以在没有底物的条件下与Ser<94>形成氢键。对这两个位点我们设计完成了四个突变体，分别为S94A、S94D、D279A和D279N，它们对异柠檬酸和Mn<2+>的K<,m>值都明显增大，而对NADP的Km值几乎没有变化，其表现出的酶活性大大降低。同时，我们对影响NADP结合的重要位点Arg<314>和His<315>进行了突变。除了R314K，其他的突变体都表现出对NADP的K<,m>值的变化，增大为野生型的25倍到90倍不等，而对异柠檬酸和Mn<2+>的K<,m>值没有明显变化。这些结果表明Ser<94>、Asp<279>、Arg<314>和His<315>在酶催化反应中都发挥着重要的作用，但起作用的方式又不尽相同，分别参与底物和辅酶的结合。通过分析结构和酶学数据，我们提出HcIDH采用稳态随机的酶促反应动力学机制。我们的研究结果为阐明异柠檬酸脱氢酶的催化机制提供了依据，并帮助我们分析理解该酶的生物学功能。
MRG15是组织中广泛表达的转录因子，在很多真核生物中都存在其同源物，它们共同组成了MRG蛋白家族。MRG15在胚胎发育、细胞增殖和细胞衰老过程中起重要作用。其羧基端独立形成一个保守的MRG结构域，参与转录调控中与Rb蛋白和另一核蛋白PAMl4的相互作用。在已有MRG结构域(MRG15C)晶体结构的基础上，我们采用酵母双杂交系统来研究MRG15上MRG结构域(MRG15C)与PAM14的相互作用方式，基于结构设计定点突变来寻找与PAM14结合中起作用的重要氨基酸位点。根据二级结构预测，我们将PAM14截成三段(PAM14N、PAM14M和PAM14C)，发现PAM14N与MRG15C的相互作用最强。随后我们进行了MRG15C单点突变和双突变体与。PAM14N的酵母双杂交实验。我们的实验结果为进一步阐明MRG15和PAM14的相互作用方式提供了一些线索。