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水稻中直链淀粉含量(AC)是影响稻米食味品质最主要的因素之一,Wx基因是控制水稻籽粒直链淀粉含量的主效基因。糊化温度是仅次子直链淀粉含量评价水稻稻米品质的另一重要指标,Alk基因是控制水稻糊化温度的主效基因。通过对Wx和Alk基因进行等位基因分析,可以为改良水稻稻米品质提供理论基础。从而开展水稻设计育种,对水稻品质改良具有重要意义。本研究分为三部分:一、检测碱基突变的功能标记的开发,及相应功能标记在Wx基因和Alk基因中的利用。二、以来源于不同供体携带有单个Wx基因的SSSLs为材料,对水稻不同Wx等位基因成熟mRNA的表达量以及cDNA序列进行分析。三、以来源于不同供体携带有单个Wx基因和Alk基因的聚合片段为材料,研究Wx基因和Alk基因的互作效应。对以上三部分进行研究,获得如下结果。
⑴由于水稻Wx基因第1内含子5’剪接位点G/T单碱基的改变是影响稻米直链淀粉含量高低的重要原因,而且Alk基因中连续两个碱基GC/TT的突变,是影响糊化温度的关键因素,所以可以通过检测相应突变碱基来预测其表型。本研究中的功能标记能直接用来检测Wx基因中的G/T突变和Alk基因中的GC/TT突变。最为重要的是这些检测突变碱基的功能标记,无需进行酶切反应,因此省时、省力且大大降低了成本。通过对28个材料的功能标记分析和表型鉴定,表明相应的功能标记能准确区分不同的基因型。
⑵通过对直链淀粉含量进行测定,依据表型和序列上的差异,将Wx等位基因分为五种复等位基因,分别对应高AC组、较高AC组、中AC组、低AC组和糯性组。通过半定量分析发现,5组Wx基因成熟mRNA的表达量大小总体表现为高AC、较高AC和中AC组>低AC组>糯性组,差异显著。在高AC组、较高AC组和中AC组之间,mRNA的表达量没有发现显著差异,表明位于第一外显子、翻译起始位点之前的(CT)n多态性对转录没有显著影响。相反,由于内含子未经正常剪切而形成的非成熟mRNA的表达量上,糯性组>低AC组,差异显著。而高AC、较高AC和中AC组则没有表达。
⑶通过对12种材料cDNA测序分析发现:在Wx基因的编码区中共有3处SNP的变化,其中两处SNP的变化引起相应氨基酸的变化,而且这两处SNP在不同组系间有着规律性的变化。对于序列X62134,1123bp处A到C的变化,引起相应氨基酸从酪氨酸到丝氨酸的转变。1695bp处C到T的变化,引起相应氨基酸从脯氨酸到丝氨酸的转变。
⑷通过对Wx基因和Alk基因的互作效应分析发现,高糊化温度的材料与具有中等或低等直链含量的材料聚合以后,可以进一步降低品种的直链淀粉含量。表明Alk基因对Wx基因有一定的影响。相反,糯性组的材料与低糊化温度的材料聚合以后,能极显著地提高品种的糊化温度。而中AC、低AC和糯性组的材料与较高糊化温度的材料聚合以后,能极显著地进一步提高品种的糊化温度,表明Wx基因对Alk基因也有一定的影响。
⑸本研究利用单片段代换系对水稻Wx基因的转录水平、Wx基因和Alk基因的互作以及Wx座位cDNA的单倍型进行了分析,并对相应基因发展了功能标记。本研究结果为进一步利用优良的水稻基因开展设计育种和深入研究等位基因变异机理及其遗传分化规律奠定了基础。