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松茸学名Tricholoma matsutake,是珍稀濒危的食用兼药用菌。云南是我国松茸主产区之一,但由于不合理采收,致使松茸产量逐年下降。本论文研究了松茸自然生态环境,使用ISSR及ITS两种分子标记研究松茸的遗传多样性,以及生态环境与遗传多样性的关系。主要研究如下:
(1)本论文在大量野外工作的基础上,比较、分析云南省范围内产松茸的植被类型的异同以及松茸发生的生态环境条件。在滇中地区(昆明、楚雄、大理),常见的植被类型为云南松林或由云南松与壳斗科植物组成的针阔叶混交林,在滇西北地区(丽江、中甸),松茸发生常见的群落类型有高山松林;适量的枯枝落叶层对松茸的出现有利;松茸圈多形成于有一定坡度、地表有凹凸的南坡至西南坡上;关键时期松茸对水分有特殊要求;松茸主要分布在3000~4000米地带,其昼夜温差大;松茸从出土到老熟历时19~20天。
(2)利用16条ISSR引物,对来自中甸、大理、楚雄和昆明的云南松茸四个居群共42个个体的遗传多样性进行了研究。结果表明,ISSR-PCR共扩增出76条条带,其中多态性条带为60条,总多态位点百分率PPB=76.92%;每个引物扩增出3-6条,平均5条;中甸、大理、楚雄和昆明的多态位点百分率分别为56.76%、67.75%、70.27%和50.00%;总的基因多样度指数(Ht)为0.3215,居群水平的Nei基因多样度指数(Hs)为0.2447,Shannon的多样性指数(I)为0.4717,居群间的遗传分化系数Gst为0.2471,基因流Nm为1.5234,这说明云南松茸具有较高的遗传多样性,且四个居群的遗传多样性主要存在于居群之间,居群内的变异较小;遗传距离表明云南中甸地区和昆明地区居群的亲缘关系最远。
(3)利用ITS序列的通用引物(ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC;ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG),对云南地区松茸16个子实体(来源地点同上)的DNA进行了PCR扩增及测序。结果表明,ITs-PCR扩增片段经琼脂糖凝胶电泳,长度大约为670bp,而产物纯化后进行测序,共有673个碱基。将这16个样品的ITS序列通过软件Clustal X进行比对分析,再用MEGA 3.1软件以邻近法进行聚类,并用Bootstrap test进行评估。由聚类图这16个样品分为两个大的分支,其中海拔较高的中甸与丽江基本聚为一支,海拔较低的禄劝与武定又聚为另一支。中甸、丽江地区的样品为栎松茸,滇中地区的样品为松茸。每个大支上的不同样品的序列又有微小的差异,这可能是由ITS序列在进化过程中发生了少量位点的变异,如碱基之间的转换、颠换和缺失等造成的。