应用酵母双杂交体系筛选IFP35相互作用蛋白

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干扰素诱导蛋白35(interferon-induced 35-kDa protein,IFP35) 是一种干扰素诱导产生的具有亮氨酸拉链结构的蛋白,其在细胞内的表达受到干扰素的调控,但IFP35的具体功能尚不清楚。本实验室前期的研究发现IFP35与牛泡沫病毒(bovine foamy virus,BFV)的反式激活因子BTas具有相互作用,暗示IFP35可能在细胞抗病毒的过程中具有重要的作用,其具体的作用机制有待进一步探索。 本文在实验室前期工作的基础上,以IFP35为材料,利用酵母双杂交系统大规模筛选人体细胞内与IFP35具有相互作用的蛋白,对IFP35本身在细胞内的功能进行了初步研究,试图探索在宿主细胞抗病毒过程中所涉及的IFP35相关蛋白以及相关机理。 本文的主要结果如下:1、将pGBKT7-IFP35转化入酵母细胞后,利用自身转录激活测试系统测试,结果表明IFP35没有自身转录激活活性,可以进行酵母双杂交筛选;2、完成了大量的筛选验证工作,并首次从人B细胞cDNA文库中成功获取了与诱饵蛋白相互作用的蛋白葡萄糖调节蛋白 78 (glucose regulated protein78,GRP78) 及真核细胞翻译延长因子1α1(eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1,eEF1α1),为下一步研究工作做准备;3、成功地从人B细胞cDNA文库中获得了GRP78及eEF1α1基因,并验证正确;4、成功地将 GRP78 及eEF1α1基因克隆至真核表达载体pCMV-Tag系列上,并成功地表达出融合蛋白;5、用免疫共沉淀方法验证了GRP78及eEF1α1与IFP35的相互作用也存在于哺乳动物细胞(293T)中;6、利用细胞免疫荧光技术将GRP78及eEF1α1与IFP35蛋白分别定位在同一空间位置,进一步证明了在哺乳动物细胞(HaeLa)中,GRP78及eEF1α1确实可以与IFP35相结合。 本文利用酵母双杂交系统获得了GRP78和eEF1α1两种细胞内与IFP35有相互作用的蛋白,为研究IFP35在细胞内的功能,以及在IFP35抗病毒过程中的具体机制奠定了一定的基础。
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