【摘 要】
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目的:研究原癌基因pokemon在HepG2细胞中对细胞周期蛋白依耐性激酶CDK2基因表达的调控作用。方法:1.构建不同长度的CDK2启动子荧光素酶报告基因载体,分别转染到HepG-2中,通过
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目的:研究原癌基因pokemon在HepG2细胞中对细胞周期蛋白依耐性激酶CDK2基因表达的调控作用。方法:1.构建不同长度的CDK2启动子荧光素酶报告基因载体,分别转染到HepG-2中,通过双荧光素酶报告基因检测法检测pokemon对CDK2启动子活性的影响。2.染色质免疫共沉淀技术检测细胞内pokemon蛋白与CDK2启动子相互作用的关系。3.点突变技术确定pokemon与CDK2启动子结合的可能位点。4.Real-Time PCR技术检测pokemon对CDK2 mRNA表达的影响。5.Westernblot技术检测pokemon对CDK2蛋白表达的影响。结果:1.双荧光素酶报告基因显示: CDK2基因ATG上游528bp为CDK2启动子的核心活性区域,pokemon在HepG2细胞抑制了CDK2启动子活性。2.染色质免疫共沉淀技术显示:细胞内pokemon可通过直接结合CDK2启动子来调控CDK2的表达。3.点突变技术显示:-259 bp至-249bp可能是pokemon与CDK2启动子结合的序列。4. RealTime-PCR显示: pokemon可下调HepG2细胞中CDK2 mRNA表达水平。5.Westernblot显示:pokemon可降低HepG2细胞中CDK2蛋白表达水平。结论:1.在HepG2细胞内pokemon可通过直接与CDK2启动子的结合调控CDK2启动子活性, -259 bp至-249bp可能是pokemon在CDK2启动子上的重要调控元件;2.在肝癌细胞HpG2中pokemon可下调CDK2 mRNA水平,可降低CDK2蛋白表达。
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