论文部分内容阅读
肝纤维化（hepatic fibrosis）是慢性肝病的共同病理学基础，是形成肝硬化的必经病理阶段，其特征是以胶原为主的细胞外间质(extracellular matrix，ECM)成分合成增多和/或降解相对不足而在肝内过量沉积。尽管不同肝病的发病机制有所不同，但其发生纤维化的最终途径相似，其中最关键的环节是肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）的激活。HSCs是产生ECM的主要来源，HSCs的活化和增殖是肝纤维化发生的关键。越来越多的研究认为HSCs活化和增殖与其凋亡受到抑制有关，而核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）能抑制多种类型的细胞凋亡。因此，NF-κB已成为当前研究的热点之一。NF-κB是一个广泛存在的转录调节因子，参与诸多病理、生理过程的基因调控，并在细胞的抗凋亡过程中发挥至关重要的作用。其在静止态HSCs中并无活性，但在激活态HSCs中活性却持续存在。因此，有理由相信NF-κB可能通过抑制HSCs凋亡而使活化的HSCs数量维持在相当水平，最终导致肝纤维化的发生。作为可诱发的转录调节因子，NF-κB结合位点可接受多种免疫刺激，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）、白细胞介素（interleukin，IL）-1、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）或T细胞激活剂；此外，<WP=5>紫外线照射、电离幅射、炎症性细胞因子、生长因子以及细菌或病毒感染等均可激活NF-κB。其中许多诱导NF-κB的刺激物都能通过诱导氧化应激反应而激活NF-κB，故反应性氧中间体(reactive oxygen intermediates，ROIs)在NF-κB活化过程中起较重要的作用。吡咯烷二硫氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)既能直接清除ROIs，又能够与ROIs相关酶中的金属离子发生螯合作用，从而抑制这些酶的活性，减少ROIs的产生。因此PDTC可以有效地拮抗NF-κB活性，诱导HSCs凋亡。迄今为止，NF-κB参与多种炎症、免疫、细胞增殖和凋亡等病理、生理过程的调控已见较多报道，但NF-κB在肝纤维化及HSCs增殖、凋亡中的作用报道甚少。为此，本研究以NF-κB为切入点，有机结合整体和离体实验，研究NF-κB在肝纤维化过程中的动态表达以及PDTC对TNFα刺激的肝星状细胞凋亡的诱导作用。实验内容主要包括以下两部分：第一部分：NF-κB在胆总管结扎大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达目的：探讨NF-κB在实验性大鼠肝纤维化形成过程中的动态表达。方法：采用胆总管结扎(bile duct ligation，BDL)大鼠肝纤维化模型，将80只雄性Sprague Dawley大鼠随机分成假手术组与模型组。模型组分别于结扎后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉动物，假手术组与4wk模型组同批麻醉。采用HE染色和Masson三色染色确定模型建立情况；用<WP=6>Western Blotting方法研究NF-κB蛋白含量在肝纤维化不同时期的动态变化；用免疫组织化学方法研究NF-κB在肝纤维化不同时期肝组织中的分布。结果：①Western Blotting方法显示正常大鼠肝组织中即有NF-κB蛋白表达，随着造模时间的延长表达逐渐上调，造模4wk时表达最多。造模1～4wk大鼠肝组织中NF-κB蛋白表达分别增加了17.41%、27.47%、66.03%和89.87%。②免疫组织化学方法显示纤维化肝组织中NF-κB阳性细胞增多。在肝纤维化早期，NF-κB阳性细胞主要分布在肝细胞内，随着肝纤维化程度的加重，NF-κB主要表达在纤维间隔、汇管区和胆管周围。结论：肝纤维化形成过程中NF-κB表达明显增加，NF-κB表达增加在肝纤维化形成与发展中起一定作用。第二部分：吡咯烷二硫氨基甲酸盐对TNFα刺激的肝星状细胞凋亡的诱导作用目的：探讨PDTC对TNFα刺激的HSCs凋亡的影响以及此过程中NF-κB的变化。方法：应用体外HSCs培养技术，采用直接细胞计数法及MTT方法测定HSCs增殖；光学显微镜及Hoechst 33258荧光染色方法观察凋亡细胞的形态学改变，膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)双标记流式细胞术(flow cytometry，FCM)测定HSCs凋亡率；免疫组织化学方法测定NF-κB在HSCs中的分布；采用Western Blotting方法测定NF-κB蛋白表达，电泳迁移率改变实验(electrophoretic mobility shift assay，EMSA )测定NF-κB活性变化。<WP=7>结果：①直接细胞计数法显示，TNFα可促进HSCs增殖，其中0.5ng·mL-1TNFα组促HSCs增殖作用最强。②MTT方法测定显示PDTC 5(mol·L-1、10(mol·L-1、20(mol·L-1及40(mol·L-1组与0.5ng·mL-1TNFα组相比，增殖抑制率显著上升，分别为24.59%、38.51%、65.57%和81.16%，P＜0.05。③Hoechst 33258荧光染色显示：对照组细胞核呈弥散均匀的荧光；PDTC组部分细胞的细胞核或细胞质内出现浓染致密的块状或颗粒状荧光，提示细胞核浓缩、染色质凝集、DNA片段化，细胞出现凋亡。④PDTC作用于HSCs 24hr，5(mol·L-1、10(mol·L-1、20(mol·L-1及40(mol·L-1组凋亡率分别为3.61%、8.69%、10.14%和16.11%，呈明显剂量依赖关系，P＜0.05。对照组及TNFα组分别为3.27%和2.79%。⑤免疫组织化学方法显示：对照组及TNFα组NF-κB阳性细胞较多，细胞形态正常，且TNFα组阳性细胞数高于对照组；PDTC组阳性细胞减少，并出现浓染致密的凋亡细胞。⑥Western Blotting方法显示对照组N