烟草PXG和HPL基因的克隆和功能研究

• 作 者: 丁超
• 出 处: 河南农业大学
• 发表日期: 2020年04期
• 关键词: 烟草 脂氢过氧化物裂解酶 过氧羟基脂肪酸羟化环氧酶 基因克隆

烟草是一种重要的经济作物,其产量和品质受到许多因素影响。遗传因素、土壤因素、生物和非生物胁迫如打顶、病虫害、干旱、低温等都会影响烟草的产量和品质。脂氧合途径对植物生长发育有着重要作用,脂氢过氧化物裂解酶(HPL)和过氧羟基脂肪酸羟化环氧酶(PXG)是脂氧合途径下游比较重要的两种酶,前者催化脂肪酸过氧化物裂解生成挥发性的短链醛和含氧酸,是植物香气的成分之一;后者催化形成环氧羟基脂肪酸,被证明具有抗菌活性。香气是烟草品质的重要指标,抗病性是烟草产量的保证,能否利用PXG和HPL来提高烟草品质和抗性还不清楚。为此,我们做了以下工作:(1)从烟草中克隆了HPL和PXG基因序列,对其进行生物信息学分析,发现其与其他物种的同源性较高,证明我们得到的确实是烟草NtHPL和NtPXG。从NCBI上找到NtHPL和NtPXG的启动子序列,发现顺式作用元件中包含有许多响应激素和胁迫处理的元件,如干旱、机械损伤、脱落酸等,表明NtHPL和NtPXG的表达可能受到多种因素调控。(2)对NtHPL和NtPXG进行组织特异性表达分析,发现NtHPL和NtPXG在烟草根、茎、叶中都有表达,前者主要在叶中表达,后者主要在根中表达。对NtHPL和NtPXG进行时期特异性表达分析,发现NtHPL和NtPXG在烟草各个时期都有表达,NtHPL主要在成苗期表达,NtPXG主要在成熟期表达。研究还发现NtHPL对MeJA、机械损伤处理都有响应,NtPXG对MeJA、SA、ABA等激素处理都有一定程度的响应。(3)构建NtHPL和NtPXG的过表达载体和沉默表达载体,并将其转入烟草,获得转基因烟株,从DNA水平和RNA水平鉴定,发现转NtHPL过表达载体的烟株中NtHPL的表达量是对照组的3.6倍,转NtPXG过表达载体的烟株,其NtPXG表达量是对照组的12.3倍,表明载体已成功转入烟草植株,并且表达效果较好。(4)对转基因烟株进行真菌和TMV侵染实验。真菌侵染后发现对照组叶片发黄,与对照相比,PXG过表达烟株叶片颜色几乎没有变化。TMV侵染后,荧光定量检测TMV、β-1,4-葡聚糖酶表达量。与对照相比,PXG过表达烟株中TMV表达量是对照的0.6倍左右,且β-1,4-葡聚糖酶表达量表达量比对照要高,β-1,4-葡聚糖酶是植物的抗病相关的酶,说明PXG可能参与对TMV的响应。