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胚胎期和哺乳期是机体发育的重要时期,从生命的起源到发育成型要经历细胞增殖、分化、迁移和程序性调亡等一系列复杂的过程。上世纪90年代末,英国学者提出“成人疾病的宫内起源”假说,该观点发布后引起国内外广泛关注,学者们认为围产期经历的环境对于成年后健康影响巨大,可能影响机体成年后患心血管疾病、代谢性疾病和肾脏疾病等各种慢性非传染性疾病的风险。有研究发现宫内发育进程中胎盘功能不全、母体低蛋白质饮食、糖皮质激素暴露和高脂饮食等因素都会影响先天肾脏发育,可能会导致胎儿和新生儿肾单位数量降低,增加成年后疾病负担。邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl)-phthalate, DEHP),是生产聚氯乙烯产品中广泛使用的一种增塑剂,可以通过消化道、呼吸道及皮肤接触等途径进入人体。DEHP及其在体内的主要代谢产物邻苯二甲酸单乙基己基酯(Mono(2-ethylhexyl) phthalate, MEHP),均可以通过胎盘和乳汁进入子代体内,影响胎儿和新生儿的健康。既往关于DEHP的研究主要集中在短期高剂量暴露上,发现DEHP可以诱发肝毒性、睾丸毒性、肾脏毒性、发育障碍和生殖毒性等。考虑到MEHP是PPARs受体的激活剂,MEHP通过与PPARa结合可以影响能量代谢,与PPARy结合可能影响细胞分化。另外,PPARs可以影响糖皮质激素和肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)的功能,从而直接或间接影响输尿管芽(ureteric bud, UB)在肾发生过程中的分支,干扰肾脏发育进程。因此,我们推测围产期暴露于DEHP可能会对子代大鼠肾脏发育产生影响。本研究首先在胚胎期和哺乳期通过母体将子代间接暴露于DEHP,观察DEHP对肾脏发育的影响,并观察子代大鼠成年后肾脏和血压的改变；然后,我们在断乳后给予部分大鼠高脂饮食,观察围产期DEHP暴露和成年高脂饮食对大鼠肾脏损害的协同作用；此外,选择肾脏发育窗口期的胚胎肾脏做基因表达谱分析,进一步探索DEHP损害肾脏发育的机制。第一部分围产期暴露于DEHP影响子代大鼠肾脏发育目的：探讨围产期通过母体间接暴露于DEHP对子代大鼠肾脏发育的影响及可能的机制。方法：将孕鼠随机分为三组：对照组、低剂量组和高剂量组。从受孕0天开始直至仔鼠出生后第21天断乳,分别进行玉米油和不同剂量的DEHP(0.25和6.25mg/kg body weight/day)灌胃染毒。测量子代大鼠体重、肾重、血压、肾功能等变化；通过H&E染色法、PAS染色和masson染色观察子代大鼠肾脏病理学变化,并且通过电镜观察肾脏超微结构变化；采用ELISA、Griss法和免疫组化切片法分别检测成年子代大鼠血清肾素、血管紧张素Ⅱ、内皮素-1和一氧化氮等血压调节相关指标；同时,采用Q-PCR、western blotting和免疫组化切片法分别检测幼年子代大鼠RAS、PPARs、肾脏早期发育相关基因和结构相关基因的变化。结果：与对照组相比,围产期通过母体间接暴露于DEHP会使断乳期子代大鼠肾单位数量降低、肾小球体积增大、肾小囊缩小等病理学改变,成年大鼠逐渐出现肾小球硬化、肾间质纤维化、足细胞足突肿胀甚至消失等病理学变化。并且,母体暴露于DEHP的子代大鼠成年后血压显著升高,RAS功能激活,肾功能显著降低,表现为内生肌酐清除率降低、血尿素氮升高、尿总蛋白升高。并且,肾脏肾素和血管紧张素Ⅱ的蛋白表达水平在出生时显著降低,但在断乳期显著升高。此外,母体暴露于DEHP同样也会导致肾脏分化关键基因Foxdl, Gdnf, Pax2和Wnt11的mRNA表达水平在出生时显著降低；肾脏发育结构相关基因Bmp4, Cdh11, Calm1和Ywhab的mRNA表达水平在出生时显著升高。结论：母体DEHP暴露将会影响子代大鼠肾脏发育,导致肾单位数量降低,以致成年后大鼠肾功能损害和血压升高。研究表明母体暴露于DEHP通过抑制子代RAS功能,影响肾单位发育和成年肾脏疾病。第二部分围产期暴露于DEHP加剧子代子代高脂饮食诱导的肾损害目的：第一部分研究显示围产期暴露于DEHP可以影响子代大鼠肾脏发育,在本部分,我们引入高脂高糖的暴露因素,进一步探讨围产期暴露于DEHP与子代断乳后高脂饮食暴露的协同效应及可能的影响机制。方法：将孕鼠随机分为对照组和试验组,从受孕0天开始直至仔鼠出生后第21天断乳,分别进行玉米油和DEHP (1.25mg/kg body weight/day)灌胃染毒。每组断乳后,子代被随机分为两个亚组,给予正常饮食(Normal diet, ND)或高脂饮食(High fat diet, HFD)。测量子代大鼠体重、肾重、血压、肾功能等的变化；通过H&E染色法、PAS染色和masson染色观察子代大鼠肾脏病理学变化；同时,采用Q-PCR、western blotting和免疫组化切片分别检测成年及幼年子代大鼠RAS系统、PPARs、肾脏早期发育相关基因和结构相关基因的变化。结果：研究发现,围产期暴露于DEHP会降低出生时子代大鼠肾单位的数量,增加肾脏PPARs蛋白质的表达,降低肾素-血管紧张素系统(RAS)蛋白质的表达。在成年期,如预期一样,高脂饮食显著增加大鼠的体重和血压。另外,DEHP或高脂饮食均可引起子代大鼠肾功能不全和肾小球硬化,并且同时暴露于DEHP和高脂饮食的子代大鼠肾脏损害现象最为严重。此外,围产期DEHP暴露会使高脂饮食暴露的子代大鼠肾脏PPARs蛋白的表达降低,RAS和TGFβ1蛋白的表达增加。结论：通过围产期间接暴露于DEHP与断乳后高脂饮食对于子代大鼠的肾损害具有协同效应。其影响原因可能是暴露于DEHP后,一方面降低子代肾单位数量,使肾脏功能过度代偿；另一方面使子代PPARs功能失调,肾脏自我保护能力降低。第三部分胚胎期DEHP暴露对大鼠肾脏发育窗口期肾脏基因表达谱的影响目的：分析暴露于DEHP对子代大鼠肾脏发育窗口期肾脏基因表达谱的影响,进一步探索胚胎期DEHP暴露对肾脏发育可能的影响机制。方法：将孕鼠随机分为对照组和试验组,从受孕0天开始分别进行玉米油和DEHP (0.25mg/kg body weight/day)灌胃染毒。在胚胎期14.5天和16.5天分别处死一批孕鼠取胚胎,分别标记为E14.5-C(胚胎期14.5天对照组)、E14.5-D(胚胎期14.5天DEHP组)、E16.5-C(胚胎期16.5天对照组)与E16.5-D(胚胎期16.5天DEHP组)。部分胚胎做HE染色观察肾脏的病理学改变,部分胚胎分离肾脏,提取肾脏RNA,制成混合样本应用表达谱分析技术,筛选差异表达基因,并对其进行聚类分析、Gene Ontology功能显著性富集分析和Pathway显著性富集分析。结果：胚胎期暴露于DEHP会导致子代大鼠肾脏发育不良。DEHP组与对照组相比,在E14.5天子代大鼠肾脏基因表达差异比E16.5天显著。并且,E14.5-D与E14.5-C的差异基因,和E16.5-C与E14.5-C与之间的差异基因变化规律相似；E16.5-D与E16.5-C的差异基因,和E16.5-D与E14.5-D之间的差异基因变化规律相似。另外,E14.5-D与E14.5-C的差异基因主要集中在细胞内,E16.5-D与E16.5-C的差异基因主要集中在细胞外区域,E16.5-C与E14.5-C的差异基因主要集中在细胞内,E16.5-D和E14.5-D的差异基因主要集中在收缩纤维。另外,E14.5-D与E14.5-C、E16.5-C与E14.5-C在PPAR信号转导、wnt信号转导、代谢等通路发生了变化,E16.5-D与E16.5-C在凋亡、黏附等通路发生了变化,E16.5-D与E14.5-D在蛋白质的消化吸收等通路发生了变化。结论：我们认为E14.5比E16.5肾脏发育更敏感,胚胎期DEHP暴露通过参与肾脏发育关键期PPAR通路、Wnt通路、糖脂代谢、凋亡等及相关信号通路,降低了基因的敏感性,影响了细胞、器官及系统的发育进程,导致胚胎大鼠肾脏发育速度加快,肾单位发育不足。