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大量动物实验和临床研究已证明采用骨髓来源的细胞系、骨骼肌母细胞和胚胎干细胞进行细胞移植能改善心肌梗死后心功能,但其机制尚不清楚。目前公认的细胞移植改善心功能的主要机制有：移植细胞的潜在的分化为血管和心肌样细胞的能力：刺激血管新生等。急性心肌梗死的修复与急性炎症反应有关,涉及了不同细胞类型之间动态相互作用,最终导致肉芽组织取代了受损伤的心肌细胞。众所周知,肥大细胞参与了肉芽组织的形成。肥大细胞是重要的多功能的分泌细胞,它们来源于骨髓CD34+的造血干细胞,且为c-Kit阳性细胞。肥大细胞很有可能通过激活细胞因子瀑布而启动了炎症反应和组织修复作用,从而在心肌梗死的修复过程中起到了重要的作用。相关研究已证明：①移植肥大细胞到野生小鼠急性心肌梗死模型的梗死处心肌内,可改善心肌梗死后心功能。②肥大细胞是介导炎症反应及速发型变态反应的重要枢纽,成纤维细胞是有潜在的致纤维化作用的细胞,研究发现两者无论是在组织分布上还是功能上都有着密切的联系。在炎症反应和组织纤维化中,肥大细胞与成纤维细胞间的相互作用已经成为研究肥大细胞在基因缺陷小鼠(Kit W/W-v)心脏中作用的重点。③缺乏c-Kit信号将导致心功能减低。在c-Kit基因缺陷的小鼠(Kit W/W-v)中,缺乏了c-Kit将导致心功能减低,包括左室收缩力降低,左室收缩末压的增加；心脏与体重比例、室间隔厚度和胶原含量也有所减低。
在本实验中,我们假设：肥大细胞在心肌梗死后的组织修复中起关键性的作用。为了验证我们的假设,通过将骨髓来源的肥大细胞和无血清的培养液分别移植到c-Kit基因缺陷小鼠(Kit W/W-v)和野生型小鼠(Kit+/+)的急性心肌梗死模型中梗死处心肌内,观察细胞移植对心功能的影响,并进一步探讨其可能机制。
方法：
1.小鼠骨髓来源的肥大细胞的培养、鉴定；
2.小鼠心脏来源成纤维细胞培养、鉴定；
3.小鼠急性心肌梗死模型的建立及细胞移植；
4.利用经胸超声心动图检查检测小鼠心脏功能；
5.心肌梗死面积的测定；
6.利用免疫组织化学染色检测成纤维细胞的增殖；
7.利用MTT方法检测肥大细胞对成纤维细胞增殖的影响；
8.利用胶原凝集试验测定肥大细胞对成纤维细胞引起胶原凝集的影响；
9.利用RT-PCR测定不同来源成纤维细胞中SCF的表达。
结果：
1.骨髓来源的肥大细胞的鉴定(甲苯胺蓝染色和流式细胞仪法)
1)甲苯胺蓝染色：细胞内均呈现出大量蓝紫色颗粒。
2)流式细胞仪法：表达FcεRI-α和c-Kit的阳性细胞率分别为98％以上,而且同时表达FcεRI-α和c-Kit的阳性细胞率也达到90％。
2.心脏来源成纤维细胞鉴定为DDR2和α-SMA染色阳性细胞。
1)DDR-2示绿色荧光染色；
2)α-SMA为红色荧光染色。
3.心功能测定测定超声心动图的收缩功能指标左室短轴缩短分数(Fraction Shortening,FS)和左室短轴面积变化分数(Fractional area contraction,FAC)：在心梗后7天,在肥大细胞移植组,基因缺陷小鼠组和野生小鼠组间的FS、FAC有统计学差异,而培养液组间无统计学差异。然而在心梗14天,肥大细胞组间FS、FAC有统计学差异,2种类型小鼠培养液组问FS、FAC也有统计学差异。而野生小鼠的肥大细胞组和培养液组心梗后7天,14天一直存在统计学差异。
4.心肌梗死面积在心肌梗死后14天,基因缺陷小鼠肥大细胞组的左室心肌梗死面积百分比(41.5％±2.5％)与野生小鼠组(肥大细胞组23.8％±3.4％,培养液组30.6％±2.5％),基因缺陷小鼠培养液组(34.6％±5.O％)比较,P均＜0.05。
5.心脏成纤维细胞(α-SMA染色)在心梗后14天的心肌梗死区,野生小鼠移植组的成纤维细胞所占比例(22.8％±2.4％)高于其他三组(野生小鼠培养液组13.6％±2.4％,基因缺陷小鼠培养液组7.3％±1.2％,基因缺陷小鼠移植组3.5％±3.0％,P均＜0.001)。
6.心脏成纤维细胞的生长曲线将基因缺陷小鼠和野生小鼠来源的2种成纤维细胞分别进行培养,5天,7天,10天,14天进行细胞计数,基因缺陷小鼠组和野生小鼠2组细胞数量有统计学差异,P均＜0.05。
7.肥大细胞对心脏成纤维细胞的影响在浓度反应中将一定数量的心脏成纤维细胞与肥大细胞按照不同的比例联合培养48小时后通过MTT方法检测示,肥大细胞的数量越多可以引起更多的成纤维细胞增殖,从1:2;1:5;1:10;1:20;1:40组(242±12.4％,251±19.3％,258±12.6％,267±21.2％,386±18.8％)与对照组(只有成纤维细胞培养组=100％)比较均有统计学差异,P均＜0.05;加入compound48/80的组别明显比无此化合物的组别的成纤维细胞增生程度高且从1:1组即开始有统计学差异,P均＜0.03。由此获得最佳反应浓度。
时间曲线实验中培养成纤维细胞6天,在不同时间段加入肥大细胞,一起培养的时间越久,成纤维细胞增殖的越多,从第2天开始各时间点与对照组(无肥大细胞组)均有统计学差异,P均＜0.05,但6小时和1天无统计学差异。由此取得最佳时间点。
将基因缺陷小鼠和野生小鼠来源的成纤维细胞分别与肥大细胞按照一定比例联合培养,MTT方法结果示：虽然基因缺陷小鼠组的成纤维细胞也随联合培养时间增长而增殖,但较野生小鼠成纤维细胞增殖程度低,6小时和1天时没有统计学差异,从2天开始,3天,4天,6天均有统计学差异,P均＜0.05。
将基因缺陷小鼠和野生小鼠来源的2种成纤维细胞单独及和肥大细胞混合后加入胶原溶液中培养,24小时后测量胶原表面积示,基因缺陷小鼠成纤维细胞组对胶原的收缩能力最差(30.3％±3.0％),与其他3组有统计学差异(基因缺陷小鼠肥大细胞组50.5％±3.6％,野生小鼠成纤维细胞组49.2％±2.0％,野生小鼠肥大细胞组73.5％±1.9％)P均<0.05。
8.细胞因子对心脏成纤维细胞的影响
(1)bFGF(MTT方法)将心脏成纤维细胞与肥大细胞；bFGF;肥大细胞+bFGF;肥大细胞+bFGF-blocker分组培养(成纤维细胞组作为对照组),其中除bFGF-blocker组(1.01±3.0％)外,心脏成纤维细胞与肥大细胞(2.46±5.0％);bFGF(5.11±3.7％);肥大细胞+bFGF(7.03±7.2％)与对照组均有统计学差异,P均<0.05;成纤维细胞+肥大细胞+bFGF组的增殖最大,与肥大细胞组有统计学差异,P=0.01;成纤维细胞+肥大细胞组与成纤维细胞+bFGF组间有统计学差异,P=0.02。
(2)TGF-β(胶原凝集试验)将5组细胞在胶原溶液中联合培养24小时后检测胶原收缩表面积,只有胶原溶液作为对照组(0％),成纤维细胞(40.1％±6.2％);成纤维细胞与肥大细胞(64.3％％±3.9％);成纤维细胞、肥大细胞与TGF-β(76.8％±10.2％)成纤维细胞、肥大细胞与TGF-β-blocker(42.3％±4.2％)示,各组与对照组(只有胶原溶液组)均有统计学差异,P均<0.05;其中成纤维细胞、肥大细胞与TGF-β组与成纤维细胞加肥大细胞组有统计学差异,P<0.05。
9.心脏成纤维细胞SCF/GAPDH％
测定基因鼠和野生鼠来源的成纤维细胞SCF/GAPDH％,基因缺陷小鼠的SCF/GAPDH％为13.5％±3.0％,与野生小鼠24.5％±1.0％有统计学差异,P<0.05。
结论：
1.c-Kit基因缺陷小鼠肥大细胞移植组表现出下降的心功能和增大的心肌梗死面积。
2.在心肌梗死后基因缺陷小鼠有相对较少的成纤维细胞。
3.肥大细胞来源的介质促进心脏成纤维细胞的增殖.
4.相对于野生型小鼠,基因缺陷小鼠对于肥大细胞所引起的成纤维细胞增殖明显减低。
5.心脏成纤维细胞可促进胶原凝集。
6.在心肌梗死后,对基因缺陷小鼠所行的肥大细胞移植没有如预期表现出改善小鼠心功能和减小心肌梗死面积作用。
7.实验表明c-Kit机能障碍影响许多生理机制,而且单纯在心肌内重建肥大细胞不能挽救基因缺陷小鼠的心功能衰竭。