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研究背景BNIP3(Bcl-2 nineteen-kilodalton interacting protein 3)是一种单次跨膜的、仅含有非典型BH3结构域的Bcl-2家族蛋白,主要分布于线粒体外膜上,是一种低氧反应蛋白。近年来的研究表明BNIP3参与多种细胞生存、凋亡、分化等生物学行为的调节,在肿瘤的发生发展、心肌损伤与修复、脑缺血缺氧性损害等多种疾病模型中见诸报道。我们先前的研究表明,低氧微环境可诱导小鼠皮肤角质形成细胞BNIP3高表达,并对其迁移发挥正向调节作用。许多研究发现BNIP3对细胞自噬的调节作用,而自噬对细胞迁移的调控日益受到研究人员的关注。已有研究表明,BNIP3分布于人皮肤角质形成细胞并对其稳态及分化具有调节作用,BNIP3分布的区域可见自噬水平的上调。因此,我们推测BNIP3介导的自噬可能调节对角质形成细胞的迁移,在创面再上皮化中发挥重要作用。自噬最初是基于其包裹细胞质和细胞器的双层膜超微结构进行描述的,这种双层膜结构被称为自噬体。该过程由两种复合物的形成触发,即ULK1复合物和PIK3C3/VPS34复合物,其中含有Atg14L和Beclin 1。这些复合物位于两个泛素蛋白样的缀合系统的上游,即Atg12-Atg5和LC3-磷脂酰乙醇胺,两者延长并封闭自噬体膜。在phagophore膜伸长过程中,Atg7介导Atg12-Atg5复合物的形成,随后与Atg16L1结合并产生Atg16L1复合物。然后自噬体与内吞室(endocytic compartment)融合并在与溶酶体融合之前获得酸性和降解性质。在溶酶体内自噬货物被最终降解。自噬是一种进化上高度保守的分解代谢过程,可响应饥饿、低氧或营养条件改变而激活。近年来,越来越多的研究发现,自噬与细胞迁移密切相关。然而,自噬是否导致细胞迁移能力的增强或降低是有争议的。在某些条件下诱导自噬具有促迁移作用,而与其他条件下自噬的激活与细胞迁移的抑制相关。BNIP3可与Beclin-1竞争Bcl-2上BH3结构域的结合位点,从而破坏Bcl-2与Beclin-1的稳定结合,使Bexlin-1游离出来,启动自噬(Autophagy)。新近研究表明,BNIP3对自噬的诱导对角质形成细胞的分化及保护角质形成细胞免受UVB诱导的细胞凋亡至关重要。但BNIP3在创面愈合过程中在角质形成细胞自噬的诱导及其在角质形成细胞迁移中的作用仍不清楚。尽管BNIP3在低氧条件下通过缺氧诱导因子(HIF-1)的转录调节高度上调已经被广泛报道,但BNIP3的HIF-1非依赖性上调机制及转录后调节机制对于理解BNIP3在不同细胞和组织中的表达也是至关重要的。众所周知,低氧微环境可激活多种信号转导通路,包括AMP激活的蛋白激酶(AMPK)、HIF-1和促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路。其中MAPK是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在细胞基本生命活动中发挥重要作用,如增殖、分化、凋亡、存活和迁移。细胞外信号调节激酶(ERK)、c-Jun N-末端激酶(JNK)和p38激酶途径是哺乳动物MAPK途径的三个基本组成部分。ERK途径主要由生长因子激活(如表皮生长因子);而JNK和p38信号通路可由各种应激刺激激活,包括低氧,UVB辐射和炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子(TNF)-?。此外,低氧已被证明会激发活性氧(ROS)的积累,后者也参与MAPK信号通路的活化。因此,本研究重点探讨了BNIP3在创面愈合过程中作为促迁移分子的作用机制。我们的研究发现,低氧微环境介导的ROS累积可促进人永生化角质形成细胞HaCaT细胞p38MAPK和JNK MAPK的激活,进而上调BNIP3诱导的自噬。此外,我们还发现,抑制自噬可使低氧诱导的角质形成细胞迁移能力显著受损。这些结果揭示了一个之前尚未报道的机制,即低氧条件下ROS激活p38MAPK和JNK MAPK信号通路,促进BNIP3的上调及自噬的激活,从而促进角质形成细胞的迁移。研究方法1.采用小鼠全层皮肤缺损创面模型,收集创面愈合不同时间点的创面组织标本,通过免疫荧光及Western Blot检测创缘角质形成细胞中BNIP3、LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、P62等自噬相关蛋白表达的变化规律;通过免疫共沉淀法(CO-IP)检测LC3与BNIP3的相互作用关系,验证创面愈合过程中BNIP3对角质形成细胞自噬可能的调节作用;2.采用人永生化角质形成细胞HaCaT细胞株体外低氧培养模型,通过Western Blot检测不同低氧时间处理后HaCaT细胞中BNIP3、LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、P62等自噬相关蛋白表达的变化规律;通过透射电镜、免疫荧光检测低氧条件下自噬体生成的改变;通过自噬抑制剂氯喹(CQ)、巴弗洛霉素(BafA1)及自噬相关蛋白Atg5特异性干扰(siAtg5)手段,检测低氧条件下角质形成细胞自噬流的变化;通过活细胞工作站及细胞划痕实验检测自噬干预后角质形成细胞迁移的变化;3.通过重组腺病毒转染技术建立BNIP3稳定低表达的HaCaT细胞株;通过Western Blot及免疫荧光检查敲减BNIP3后HaCaT细胞自噬水平的改变;通过通过活细胞工作站及体外片层细胞划痕实验检测敲减BNIP3后角质形成细胞迁移的改变;4.通过活性氧检测试剂盒检测创缘表皮层ROS水平;建立小鼠乳鼠皮肤体外低氧培养模型,活性氧检测试剂盒检测低氧处理后表皮层ROS水平;通过活性氧清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理体外培养的小鼠乳鼠皮肤,通过免疫荧光和Western Blot检测低氧处理后BNIP3、LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、P62等自噬相关蛋白表达的变化;采用HaCaT细胞株体外低氧培养模型,NAC清除氧自由基后,检测BNIP3、LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、P62等自噬相关蛋白的表达变化、p38 MAPK、JNK MAPK、HIF-1?等信号通路活性的改变以及角质形成细胞迁移的改变;以p38MAPK、JNK MAPK的化学抑制剂(SB203580、SP600125)处理低氧培养的HaCaT细胞,分别检测BNIP3、LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、P62等自噬相关蛋白的表达变化和角质形成细胞迁移的改变,从而揭示在体及离体条件下低氧促进角质形成细胞BNIP3、自噬与迁移的可能机制。结果1.免疫荧光结果表明,小鼠创面愈合过程创缘角质形成细胞中BNIP3、LC3、Atg5的表达显著增加;Western Blot检测结果进一步证实,创缘角质形成细胞中BNIP3、LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、P62等自噬相关蛋白表达增加;CO-IP结果表明,在小鼠创面组织中LC3与BNIP3存在相互作用关系。这些结果提示创面愈合过程中BNIP3对角质形成细胞自噬可能具有调节作用;2.Western Blot检测发现,不同低氧时间处理后HaCaT细胞中BNIP3、LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、P62等自噬相关蛋白的表达均显著增加,并呈一定时间依赖性;通过透射电镜、免疫荧光检测结果表明,低氧条件下角质形成细胞自噬体生成的明显增加;通过自噬抑制剂氯喹(CQ)、巴弗洛霉素(BafA1)及自噬相关蛋白Atg5特异性小干扰RNA(siAtg5)干预自噬,证实低氧条件下角质形成细胞自噬流是通畅的,且自噬抑制后低氧条件下角质形成细胞的迁移明显受抑。这些结果表明,低氧条件下角质形成细胞自噬上调促进其运动及迁移能力。3.成功构建BNIP3稳定低表达的HaCaT细胞株,发现BNIP3敲减后,低氧条件下HaCaT细胞自噬水平明显下降,且细胞运动及迁移能力显著下降,进一步证实低氧条件下BNIP3介导的自噬可参与角质形成细胞迁移与运动的调节;4.创面愈合过程中创缘表皮层ROS水平显著升高;小鼠乳鼠皮肤体外低氧培养后较常氧组ROS水平升高,可模拟在体创缘;NAC可有效清除低氧诱导产生的ROS,并显著抑制BNIP3、LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、P62等自噬相关蛋白的表达;在HaCaT细胞株体外低氧培养模型中,BNIP3、LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、P62等自噬相关蛋白的表达增加,p38 MAPK、JNK MAPK、HIF-1?等信号通路活性增加,角质形成细胞迁移能力显著提高,而NAC可显著逆转这些改变;以p38 MAPK、JNK MAPK的化学抑制剂(SB203580、SP600125)处理低氧培养的HaCaT细胞后BNIP3、LC3、Atg5、Atg7、Atg16L1、Beclin-1、P62等自噬相关蛋白的表达及角质形成细胞迁移的能力受到显著抑制。由此可见,创面愈合过程中ROS生成增加,激活p38 MAPK、JNK MAPK、HIF-1?等信号通路,上调(33)(45)(40)P3介导的自噬,促进角质形成细胞的迁移。结论本研究从在体及离体角度阐明:创面低氧微环境通过促进ROS的生成,激活p38MAPK、JNK MAPK信号通路,上调BNIP3介导的自噬,从而促进角质形成细胞迁移。本研究首次探讨BNIP3介导的自噬对创面再上皮化的重要作用,对BNIP3在愈合中的功能提出新的观点,可望为临床创面治疗提供了新的可能靶点。