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前言 动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种慢性炎症性疾病，动脉内膜的炎症细胞浸润、平滑肌细胞增生、细胞外基质增加及血栓形成等多种病理改变不同程度贯穿于动脉粥样硬化的全过程。外周血单核细胞粘附于内皮并迁入内皮下间隙，摄取脂质转化为泡沫细胞是AS形成的重要早期事件，在此过程中单核细胞受多种趋化因子的招募，其中单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)对单核细胞的趋化作用已被许多研究者所证实。文献报道，同时敲除MCP-1基因和低密度脂蛋白受体基因的小鼠在喂饲高胆固醇饮食后，其动脉粥样硬化病变与单纯敲除低密度脂蛋白受体基因的小鼠相比明显减轻，但动脉的病变并未完全消失，主动脉壁内仍有巨噬细胞浸润，说明在单核细胞迁入内皮下间隙过程中，除MCP-1外，还有其他趋化因子的参与。巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)与MCP-1同属于CC型趋化因子，其主要功能是对单核细胞的趋化作用。体内实验明确证实了MIP-1α在体内可活化血管内皮，引起单核细胞、淋巴细胞浸润。MIP-1α还可趋化CD4~+CD8~+T细胞及树突状细胞迁移进入免疫反应部位，协调免疫反应的发生，并能调节外周血单核细胞基质金属蛋白酶的产生，介导基质降解，从而在单核细胞迁入动脉内膜的过程中发挥作用。在AS斑块中，T淋巴细胞、单核巨噬细胞、嗜中性粒细胞等都表达MIP-1α。由此可见，MIP-1α在AS的发生中亦起着重要作用。 糖尿病患者大血管病变组织学检查与一般AS无显著差异，但是糖尿病患者AS发生早、进展快、预后差，是2型糖尿病患者致死致残的重要原因。糖尿病患者血浆MCP-1及MIP-1α水平增高，但其在糖尿病患者动脉粥样硬化动脉内膜中的表达与分布尚未报道。本研究采用免疫组织化学方法，检测MCP-1及MIP-1α在2型糖尿病患者和非糖尿病患者动脉粥样硬化动脉内膜中的表达与分布，探讨MCP-1及MIP-1α在2型糖尿病患者动脉粥样硬化形成和发展中的作用。 内皮细胞是AS发病过程中最先被激活的细胞，内皮细胞受各种刺激后，通过分泌炎症介质或调节白细胞在其表面的粘附，引发和扩大动脉管壁的炎症反应。高血糖及长期高血糖状态下蛋白质非酶糖化形成的糖基化终产物(advaneed glyeation end produets，AGEs)是糖尿病病人体内最初和主要的代谢异常，这两种异常对内皮细胞表达MIP一1。的影响目前仍不清楚。为此我们以人脐静脉内皮细胞株ECV304为研究对象，用葡萄糖处理无血清饥饿的人脐静脉内皮细胞，检测MIP一1 amRNA及蛋白的表达水平;同时原代培养人脐静脉内皮细胞，用AGEs处理无血清饥饿的人脐静脉内皮细胞，检测MIP一1 amRNA及蛋白的表达水平，探讨葡萄糖及对AGEs对人脐静脉内皮细胞表达MIP一la的影响，为进一步研究糖尿病患者多发大血管病变提供理论依据。方法 1.动脉标本的处理: 将术中获得的新鲜标本在离体30分钟内用OCT包埋，放人液氮中迅速冷冻形成冻块，取出后用铝箔包好，编号后存人一so℃冰箱中保存。实验前于恒温冰冻切片机制成6卜m厚的冰冻切片，贴于涂有防脱片剂并处理过的载玻片上，4%多聚甲醛固定20分钟，PBS冲洗，准备用于HE染色、油红O染色及免疫组化染色。 2.细胞培养及细胞周期同步化 (l)人脐静脉内皮细胞株ECV304购自上海细胞所，用含10%(voFvol)56℃灭活的新生牛血清的RMPll640培养液，于37℃、5%CO:的条件下培养，隔天换液。0.25%胰酶消化传代，接种于预先放置有盖玻片的24孔培养板及100而培养瓶中，内皮细胞在倒置显微镜下呈铺路石状排列。将传代生长至融合状态的内皮细胞用无血清培养液饥饿24小时，此时细胞同步于G0/Gl期。(2)人脐静脉内皮细胞原代培养:采用改良Jaffe等法。取健康新生儿脐带25一ocm，PBS冲洗后注入 0 .125%胰蛋白酶刁.02%ED-TA室温消化15一O而n，收集内皮细胞悬液，离心后用含20%56℃灭活的新生牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，调整细胞数在3 xlo，个/耐，接种于预先放置有盖玻片的24孔培养板及100血培养瓶中，隔天换液。间接免疫荧光法测定姗因子相关抗原进行内皮细胞的鉴定。细胞生长至融合状态后，无血清培养液培养24h。 3.油红O染色 固定后的冰冻切片用60%异丙醇浸泡305，然后于油红O稀释液中55℃浸泡40而n。用60%异丙醇浸泡105，苏木素染色2而n，自来水冲洗5而n，最后甘油明胶封片。 4.免疫组化染色 (l)SP法: 每张切片加l滴3%过氧化氢阻断液，以阻断内源性过氧化物酶活性，室温下孵育10min。PBS冲洗(3 xs’)。每张切片加1滴正常兔血清封闭液，室温下孵育巧而n，倾余，不洗。每张切片加1滴羊抗人MCP一1多克隆抗体(1:100)，4℃过夜。PBS冲洗(3 xs‘)。每张切片加1滴生物素标记的第二抗体，室温下孵育巧而n。PBS冲洗(5 xs‘)。每张切片加l滴链霉菌抗生素蛋白过氧化酶溶液，室温下孵育巧而n。PBS冲洗(3 xs‘)。每张切片加2滴新鲜配制的DAB显色15一omin，苏木素复染，中性树胶封片。 (2)SABC法: 30%过氧化氢+纯?