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微生物二步发酵法是国内维生素C生产的主要方法,但由于二步发酵的产酸效率已经较高,产量的进一步提高难度较大。如能将二步发酵工艺改进为一步发酵,可降低发酵步骤,显著节约能耗,降低污染,显著提高经济效益。本文通过研究谷胱甘肽(GSH)等外源物质对氧化葡萄糖酸杆菌和酮古龙酸杆菌一步混菌发酵体系的影响,构建和优化酮古龙酸杆菌(Ketogulonicigenium vulgare)、氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)和植物内生芽孢杆菌(B.endophyticus)三菌混菌一步发酵体系,及利用合成生物学手段在大菌中构建裂解模块、敲除山梨醇脱氢酶等的方法,构建优化维生素C一步发酵体系,为进一步阐明维生素C一步发酵过程中菌种间相互作用关系和发酵工艺优化提供依据。GSH能有效促进酮古龙酸杆菌的生长。本研究就GSH对氧化葡萄糖酸杆菌和酮古龙酸杆菌一步混菌发酵的作用进行了探索,研究发现,在5L的发酵罐中,外加1 mg/ml的GSH对混菌的发酵有着显著的促进作用,2-酮-L-古龙酸(2-KGA)产量提高了22.8%。通过16S rDNA荧光定量PCR法测菌数,发现GSH的添加使酮古龙酸杆菌的生长提高到148%,但抑制氧化葡萄糖酸杆菌的生长,使其生物量下降到61%。运用代谢组学方法分析发现,GSH能促进酮古龙酸杆菌的磷酸戊糖、三羧酸循环、硫酸盐等代谢,同时减缓氧化葡萄糖酸杆菌对L-山梨糖的消耗,以促进整个混菌体系的发酵效率。设计构建了K.vulgare、G.oxydans和B.endophyticus三菌混菌一步发酵体系,通过优化发酵条件,使补料发酵过程醇酸转化率达到了81.89%;分批发酵过程中醇酸转化率达到了87.9%,为放大到工业化规模提供依据。并且发现在有山梨醇存在的条件下酮古龙酸杆菌及其伴生菌能够快速的生长增殖,植物内生芽孢杆菌在发酵10h不断消耗山梨醇的特性。为了提高三菌一步发酵效率,运用合成生物学手段,敲除大菌消耗山梨醇的基因,使得体系中对于山梨醇的浪费减少,通过导入催化山梨醇生成山梨糖的基因发现,可以在芽孢杆菌中实现其微弱作用;此外,在大菌中构建裂解模块,结果表明,可以在特定的时间段内达到裂解大菌的目的,使细胞生物量降低约18-27%。本研究为进一步优化VC三菌一步发酵过程奠定基础。