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鼠伤寒沙门菌(Salmonella Typhimurium)是一种重要的人兽共患病原菌,当细菌处于生物被膜(Biofilms)状态时其基因表达较富营养状态发生较大变化。RpoE作为一种σ因子,能够调控生物被膜形成,可增强细菌对不良环境的抵抗力,并且可影响鼠伤寒沙门菌的致病力。毒力岛1(SPI-1)和毒力岛2(SPI-2)编码的Ⅲ型分泌系统(T3SS)是鼠伤寒沙门菌的主要毒力因子,且不同SPI编码的T3SS及其分泌的效应蛋白在细菌致病的各个阶段发挥不同作用。因此,RpoE可能通过调控T3SS及其效应蛋白的表达进而影响鼠伤寒沙门菌的毒力。本研究以生物被膜形成能力较强的鼠伤寒沙门菌S025及其rpoE基因缺失株为供试菌进行探究,确定RpoE在生物被膜和非生物被膜状态下对T3SS及效应蛋白的调控作用,为深入研究鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定基础。1.鼠伤寒沙门菌rpoE基因对T3SS相关基因的转录调控选取SPI-1编码的T3SS基因invA、iagB、iacP、invC及其效应蛋白基因sopE2和SPI-2编码的T3SS基因sseB及其效应蛋白基因pipB、sseL和sspH2共9个基因,分别设计特异性较好的相应基因的引物(包括内参基因gyrA),通过实时荧光定量PCR方法分别测定了鼠伤寒沙门菌野生株S025及其rpoE基因缺失株在生物被膜状态和非生物被膜状态包括富营养状态及28℃浮游状态的转录水平差异。结果显示,在生物被膜状态和非生物被膜状态下,相较于野生株,rpoE基因缺失株中invC、iacP、sseB、pipB和sseL基因表达量均显著或极显著下降,但invA和sopE2基因的表达量变化在不同培养状态时呈现完全不同的趋势,表明rpoE基因在转录水平确实对T3SS及其效应蛋白基因存在调控作用。最终我们筛选了差异显著且调控趋势比较一致的基因,包括SPI-1编码的invA和sopE2以及SPI-2编码的sseB和sseL共4个候选基因,作为进一步深入研究的重点。2.鼠伤寒沙门菌T3SS部分基因多克隆抗体的制备选取T3SS相关基因invA、sopE2、sseB及sseL共4个基因,利用原核表达载体 pET-30a/32a 和 pGEX-6P-1,构建得到相应的重组质粒 pET-30a-invA、pET-32a-sopE2、pGEX-6P-1-sseB和pGEX-6P-1-sseL。将构建的重组质粒转化入BL21(DE3)感受态细胞,优化条件,诱导获得可溶性蛋白InvA(49kDa)、SopE2(47kDa)、SseB(48 kDa)和SseL(61 kDa)。利用试剂盒纯化后,免疫6周龄雌性BALB/c小鼠得到相应蛋白的多抗血清。采用λ-Red同源重组法构建invA、sopE2、sseB和sseL4个基因的缺失株;通过Western-blot验证多抗血清,结果显示,相应基因的缺失株中均检测不到相应的蛋白,证明多抗血清制备成功,但不同蛋白的多抗血清的特异性存在差异,为进一步探究RpoE对T3SS和效应蛋白的调控作用提供检测工具。3.RpoE对鼠伤寒沙门菌T3SS相关基因的蛋白水平调控在生物被膜形成能力较强的鼠伤寒沙门菌S025及其rpoE基因缺失株的基础上,利用原核表达载体pGEX-6P-1构建rpoE基因回复株,通过结晶紫染色方法测定了野生株、缺失株和回复株的生物被膜形成能力,证实rpoE基因在缺失株中的回复表达可以恢复生物被膜形成。构建了原核表达重组载体pET-30a-rpoE,成功诱导纯化得到比较纯净的融合蛋白RpoE-His。然后利用制备的InvA、SopE2、SseB和SseL四个蛋白的多克隆抗体作为一抗,通过Western-blot试验分别在富营养状态、28℃浮游状态和生物被膜状态测定了野生株S025、rpoE基因缺失株和回复株中四种蛋白的表达差异。结果显示,在三种状态下,鼠伤寒沙门菌S025中InvA和SopE2蛋白均受到RpoE的负调控,而SseL蛋白的表达受到RpoE的正调控,但SseB蛋白的表达只在富营养状态和生物被膜状态下受到RpoE的正调控,蛋白表达测定结果同实时荧光定量PCR结果存在一定差异。最后通过蛋白结合(Pulldown)试验测定了表达的RpoE-His融合蛋白与鼠伤寒沙门菌S025菌体中四个蛋白的相互作用关系,结果表明RpoE与上述四个蛋白均不存在直接作用关系。这些结果初步阐明了 RpoE在生物被膜状态和非生物被膜状态下对T3SS相关蛋白的调控。