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目的1.针对铜绿假单胞菌las群体感应系统的lasR/lasI基因,设计和筛选出与其mRNA紧密结合的反义寡核苷核酸序列,以此为基础设计合成反义肽核酸。2.评估反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1的生长、lasR/lasI基因表达、生物被膜形成及毒力因子表达的影响。方法一、铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸的设计与筛选1.铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义寡核苷酸的设计与筛选1.1目的基因的扩增:根据Gene Bank数据库提供的铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI全长基因序列,用软件Primer Primer 6.0设计扩增引物,进行lasR和lasI基因的PCR扩增。1.2构建lasR和lasI基因mRNA表达质粒:回收并纯化lasR和lasI基因扩增产物,与质粒载体p GEM-T easy vector进行连接重组。1.3重组质粒p GEM-T easy vector-lasR/lasI的验证:重组质粒转化感受态细菌DH5α,利用蓝白斑实验筛选出阳性克隆。扩增后提取p GEM-T easy vector-lasR/lasI质粒并进行p GEM-T easy vector-lasR/lasI Not I酶切鉴定和测序鉴定。1.4利用软件RNA structure 5.2设计lasR和lasI基因mRNA反义寡核苷酸序列。1.5反义寡核苷酸的筛选:进行lasR/lasI mRNA体外转录,利用斑点杂交实验筛选出反义寡核苷酸序列。2.铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸的设计与合成依据筛选出的反义寡核苷酸序列,按照肽核酸设计原则设计合成铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸,并将其与穿膜肽(KFF)3K连接。二、铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸生物学作用研究1.反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因表达的影响:利用q PCR方法检测lasR和lasI基因mRNA相对表达量。2.反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1生长的影响:酶标仪测定LB液体培养基中铜绿假单胞菌PAO1 OD600和LB固体培养基计数菌落。3.反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1生物被膜形成的影响:光学显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察生物膜内细菌含量。4.反义肽核酸对铜绿假单胞菌PAO1毒力因子表达的影响:采用ELISA技术检测铜绿假单胞菌PAO1外毒素A、绿脓菌素含量的变化,q PCR方法检测弹力蛋白酶lasB基因mRNA相对表达量。结果一、铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸的设计与筛选1.成功构建lasR和lasI基因mRNA表达重组质粒p GEM-T easy vector-lasR/lasI,筛选出与铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因mRNA紧密结合的反义寡核苷酸序列。2.以筛选出的反义寡核苷酸序列为基础合成反义肽核酸,并将其与穿膜肽结合构建了穿膜肽-反义肽核酸。二、铜绿假单胞菌PAO1 lasR和lasI基因反义肽核酸生物学作用研究1.lasR/lasI穿膜肽-反义肽核酸抑制lasR/lasI mRNA的表达,与对照组相比,其表达量有显著差异,并且随着穿膜肽-反义肽核酸浓度增加,对lasR/lasI mRNA的表达抑制作用增强。2.lasR/lasI穿膜肽-反义肽核酸浓度≧40μM时,对铜绿假单胞菌PAO1的生长有明显抑制作用,浓度越高,对生长的抑制作用越明显。而穿膜肽和反义肽核酸本身对细菌的生长无明显抑制作用。3.光学显微镜、扫描电镜和激光共聚焦显微镜观察结果显示,lasR/lasI穿膜肽-反义肽核酸转染的铜绿假单胞菌PAO1,其生物被膜的形成明显抑制。4.lasR/lasI调控的毒力因子弹性蛋白酶lasB、绿脓菌素和外毒素A等在穿膜肽-反义肽核酸的作用下表达量均下降,与阴性对照组相比,差异有统计学意义。结论1.通过体外表达和斑点杂交实验,成功效筛选出与目的基因lasR/lasI mRNA紧密结合的反义寡核苷酸序列,并在此基础上成功设计合成反义肽核酸并构建了穿膜肽连接的穿膜肽-反义肽核酸。2.穿膜肽-反义肽核酸明显抑制lasR/lasI mRNA的表达,实现对铜绿假单胞菌las群体感应系统的淬灭。3.lasR/lasI mRNA穿膜肽-反义肽核酸能够显著抑制铜绿假单胞菌PAO1生物被膜的形成。4.穿膜肽-反义肽核酸成功抑制铜绿假单胞菌PAO1的生长,并明显下调毒力因子弹性蛋白酶B基因及绿脓菌素和外毒素A的表达。5.本研究设计的穿膜肽-反义肽核酸可通过对铜绿假单胞菌las群体感应系统的淬灭,显著抑制铜绿假单胞菌PAO1的生长及毒力相关因子的表达,为铜绿假单胞菌感染的治疗提供新的思路。