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肝细胞移植是治疗肝衰竭和代谢性肝病的重要手段之一,相对于肝脏移植,肝细胞移植具有来源较广、费用相对低廉、创伤较小等优点,可提供暂时性肝功能支持,为肝脏重建创造机会。但同肝移植一样,排斥反应影响移植肝细胞的长期存活和远期疗效。目前解决排斥反应的主要策略是使用免疫抑制剂,但此类药物毒副作用较大,需长期甚至终身使用,且增加感染和肿瘤的发生率。在此背景下,诱导移植物免疫耐受成为研究热点。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4免疫球蛋白(cytotoxic T-lymphocyte associated antigen 4-immunoglobulin, CTLA4Ig)是CTLA4分子胞外功能区与免疫球蛋白IgG恒定区相结合的融合性可溶性蛋白,可与T淋巴细胞表面的CD28分子竞争性结合抗原递呈细胞(antigen presenting cell, APC)表面的B7分子,阻断T细胞活化的共刺激通路,抑制T细胞活化,诱导对特异性抗原的免疫耐受。大量实验已经证实CTLA4Ig可以有效抑制排斥反应,延长移植物存活时间,肝细胞移植中应用CTLA4Ig同样被证实可有效诱导免疫耐受。其主要应用方法为CTLA4Ig蛋白的全身应用或各种载体介导CTLA4Ig基因的全身转染。但此类方法同全身使用环孢霉素等传统免疫抑制剂一样,可能干扰机体整体免疫功能并导致非特异性免疫抑制。在此背景下,本研究利用重组腺病毒载体携带CTLA4Ig基因,在体外转染正常人肝细胞株L02,使L02细胞表达具有免疫抑制生物学活性的CTLA4Ig,以期建立一种通过移植肝细胞自身表达CTLA4Ig诱导免疫耐受的方法。实验方法和结果如下:一、腺病毒介导CTLA4Ig基因转染的L02细胞生物学特性的研究以重组人CTLA4Ig腺病毒载体(Ad-CTLA4Ig-EGFP)转染体外培养的正常人肝细胞株L02,观察转染效率、转染后L02细胞对CTLA4Ig的表达以及自身生物学特性的变化。结果显示:1.自转染后6小时开始L02细胞内可见绿色荧光表达,48-72小时荧光强度达峰值,可持续较强表达2周,随后逐渐衰减,28天时尚余微弱荧光;经流式细胞仪检测,重复感染度MOI为600时,转染效率约为88.0%;免疫细胞化学及Western Blotting检测提示转染后L02细胞胞浆内有大量CTLA4Ig表达,且可分泌至细胞外。ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)法检测转染后1周时上清中CTLA4Ig浓度达峰值,约为(16.55±1.20)ng/ml。2.经绘制细胞生长曲线,发现转染后初期细胞生长速度稍减慢,但无统计学意义;经检测培养上清中尿素含量,发现转染后L02细胞合成分泌尿素的能力较转染前明显升高(P<0.01)。二、CTLA4Ig基因修饰的L02细胞(CTLA4-L02)体外、体内诱导免疫耐受的研究1. CTLA4-L02与SD大鼠淋巴细胞混合培养后,以MTT法检测淋巴细胞增殖,发现增值率明显受到抑制(P<0.05),抑制率约为36.8%;经CTLA4-L02抑制后的大鼠脾脏细胞再接受正常L02细胞刺激时仅发生轻度增殖,增值率明显低于接受Hela细胞刺激的脾细胞(P<0.01)。2.将CTLA4-L02经脾脏注射移植给行2/3肝叶切除术的SD大鼠,术后第3、4周检测鼠肝组织可见表达人白蛋白阳性的细胞存活,而注射生理盐水及正常L02细胞的对照组为阴性;检测术后1周的大鼠外周血发现:1)转染组大鼠(注射CTLA4-L02)外周血CD4+T细胞比例及激活的CD4+T细胞(CD4+CD69+T细胞)比例均较未转染组(注射L02细胞)降低(P<0.01);2)转染组大鼠外周血IL-2水平较未转染组低(P<0.01)。结论:1.腺病毒载体可介导CTLA4Ig基因高效率转染人肝细胞株L02,转染后的L02细胞可在胞浆内有效表达CTLA4Ig蛋白并分泌至细胞外,表达持续时间超过4周;而自身生物学特性并未受到明显负面影响。2.转染后的L02细胞在体外表现出明确的免疫抑制效应,可明显抑制异种的大鼠淋巴细胞增殖,诱导自身发生免疫耐受,且这种耐受具有一定程度的抗原特异性;移植给大鼠后,可抑制大鼠CD4+T细胞的活化和增殖,抑制IL-2的分泌,诱导自身在大鼠肝脏内的免疫耐受和存活。