论文部分内容阅读
2009年,我国河北省秦皇岛沿岸海域首次暴发褐潮,且之后连续多年均有不同规模的褐潮暴发。褐潮的发生严重影响了当地的海洋生态系统并对海洋资源和贝类养殖业构成威胁。虽然褐潮对海洋生物的影响人们已经有了系统的认知,但褐潮藻(抑食金球藻)对海洋生物的致害机制到目前为止人们还尚无定论。褐潮藻是否产生毒素、毒素的理化性质和作用机制如何都还需要进一步探索。本论文以PC12神经细胞为研究对象,使用抑食金球藻细胞提取物进行褐潮藻毒性效应的研究。首先从细胞增殖、胞外乳酸脱氢酶渗漏、细胞形态学变化及细胞凋亡/坏死等方面探讨抑食金球藻的细胞毒性效应。根据抑食金球藻细胞毒性效应的实验结果,提出抑食金球藻细胞毒性可能是由溶血活性而导致的假设。基于此,运用光学显微镜和AFM原子力显微镜观察抑食金球藻细胞提取物对兔血红细胞的溶血现象;采用薄层色谱法对抑食金球藻溶血毒素进行初步的分离鉴定;研究多种理化因子(温度、pH、氧化剂和还原剂及二价金属离子)对抑食金球藻溶血活性的影响;以渗透保护实验及磷脂酶活性检测分析抑食金球藻溶血毒素的溶血方式,为抑食金球藻毒性效应的深入研究奠定基础,也为分析褐潮藻的危害机制提供了新的思路。本研究的主要结论如下:抑食金球藻氯仿提取物对PC12细胞的增殖具有抑制作用,且该作用呈现出时间、剂量-效应关系,染毒36h的IC50为79.94μg·mL-1,而抑食金球藻甲醇提取物对PC12细胞增殖则无明显影响,提示抑食金球藻氯仿提取物具有细胞毒性,其中可能含有毒性物质;胞外乳酸脱氢酶结果显示,较低剂量水平(>150μg·mL-1)的抑食金球藻氯仿提取物即可促进细胞乳酸脱氢酶的漏出,且漏出的量呈剂量-效应关系,说明抑食金球藻氯仿提取物可破坏细胞膜的完整性;形态学观察显示,抑食金球藻氯仿提取物作用细胞36h后,细胞形态即发生显著变化,细胞细胞形态呈现出回缩变形、细胞变圆、脱壁、肿胀,细胞突起变短变少等特点,这些特性与凋亡的形态学变化不符,暗示细胞可能发生坏死;使用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术进行细胞凋亡与坏死的检测,发现即使是最低剂量的抑食金球藻氯仿提取物也可诱导细胞发生坏死,且坏死率随着剂量的增加而增加。在光学显微镜下可见,载玻片涂有抑食金球藻氯仿提取物的一侧,兔血红细胞几乎完全破碎,而在未涂有提取物的一侧绝大多数的血细胞则完好无损,说明抑食金球藻氯仿提取物具有很强的溶血活性;原子力显微镜(AFM)结果显示,经抑食金球藻溶血毒素处理的血红细胞,细胞形态发生严重变形,呈棘红样改变,细胞表面较为粗糙,提示抑食金球藻溶血毒素对血红细胞形态的破坏较为严重;实验室条件下培养的抑食金球藻溶血活性约为21.33 ±0.45HU.L-1,单个藻细胞中的溶血单位为(1.42±0.03)×10-8HU cell-1;薄层层析结果显示,抑食金球藻溶血毒素可能为糖脂类化合物,至少含有2种组分,Rf分别为:0.90和0.76。在一定的温度范围内(4-37℃),抑食金球藻溶血活性随温度的升高而变强;酸性条件增强了抑食金球藻的溶血活性,而碱性条件则抑制了抑食金球藻的溶血活性,pH为5.0时溶血活性最高;Cu2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+、Zn2+和Hg2+等离子对抑食金球藻溶血活性均表现出一定的抑制作用,其中Hg2+的抑制作用最强,但这种抑制作用可被EDTA消除。显微镜下观察发现,较高浓度的Hg2+可诱导红细胞聚集成团,推测这种聚集效应导致了血红细胞膜表面积减小并抑制了溶血活性的表达;此外,抑食金球藻溶血活性能被氧化剂H202所抑制,被还原剂半胱氨酸盐酸盐激活,说明抑食金球藻溶血毒素为巯基依赖型溶血毒素。抑食金球藻溶血毒素的溶血图谱表明,鲷鱼血红细胞对抑食金球藻溶血毒素最为敏感,而人和鸡血细胞对抑食金球藻溶血毒素则不敏感;进一步研究发现,细胞膜组分鞘磷脂及D-木糖能显著抑制抑食金球藻的溶血活性,说明鞘磷脂及D-木糖可能是抑食金球藻溶血毒素在细胞膜上的受体;不同水合分子直径的渗透保护剂均不能有效抑制抑食金球藻的溶血作用,暗示该溶血毒素的溶血活性不是由成孔机制所引起的;卵黄琼脂平板显示,抑食金球藻溶血毒素不具有明显的磷脂酶活性,提示该溶血毒素的溶血作用也不是通过磷脂酶活性所产生的,因此推测抑食金球藻溶血毒素的溶血活性可能是通过去污剂效应所产生的。