论文部分内容阅读
越来越多的证据表明，肿瘤是一种干细胞疾病。乳腺癌的发生、发展及复发、转移，从根本上说，是由乳腺癌干细胞引起的。而且，乳腺癌干细胞对化疗、放疗及内分泌治疗都存在抵抗性。同时，肿瘤干细胞位于特定的微环境中，其为肿瘤干细胞的自我更新提供支持作用，这些微环境为肿瘤干细胞的治疗提供新的思路。目前，对乳腺癌干细胞微环境的认识还很不足。为此，我们观察乳腺间质细胞中最主要的细胞成分一成纤维细胞，对乳腺癌干细胞的调控作用。乳腺癌干细胞基因的网络调控国内外未见报道，我们构建了乳腺癌干细胞基因调控网络。
一、乳腺癌干细胞微球体形成影响因素探讨
目的：探讨MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞及原代乳腺癌细胞微球体形成的影响因素，并检测其中CD44+CD24-/low的表达。
方法：将MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞及原代乳腺癌细胞进行微球体培养。取培养第7天的微球体细胞，用流式细胞术进行干细胞比例分析。
结果：MCF-7细胞形成微球体的效率最高(2.1±0.3)％，MDA-MB-231细胞很少形成微球体，原代乳腺癌细胞未观察到微球体形成。但在无B27的干细胞培养环境中，MCF-7易贴壁生长。MCF-7单层培养细胞中CD44+CD24-/low的比例为(2.0±0.1)％，而来源不同状态的MCF-7细胞进行微球体培养，微球体细胞中CD44+CD24-/low的比例分别为(11.8±0.3)％和(8.2±0.8)％，(p<0.01)。MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞中CD44+CD24-/low的表达分别为(92.2±3.1)％和(93.8±2.4)％。
结论：MCF-7细胞通过微球体培养富集了肿瘤干细胞，而MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞则不能。MDA-MB-231及原代乳腺癌细胞中CD44+CD24-/low的表达与微球体形成不呈正相关。
二、表阿霉素对乳腺癌微球体细胞和单层培养细胞作用的比较
目的：探讨表阿霉素对乳腺癌微球体细胞和单层培养细胞的不同作用。
方法：MCF-7细胞在干细胞培养条件下进行微球体培养，噻唑蓝(thiazolyl blue，MTT)法检测表阿霉素对MCF-7微球体细胞和单层培养细胞的抑制率，流式细胞术分析表阿霉素作用下，MCF-7微球体细胞和单层培养细胞中CD44+CD24-的表达及细胞周期变化。
结果：相同浓度(>100ng/mL)的表阿霉素对MCF-7微球体细胞的抑制率明显低于对单层培养细胞的抑制率，(P<0.01)；400ng/μL的表阿霉素作用72 h，MCF-7微球体细胞的CD44+CD24-/low比例为(22.8±4.8)％，高于单层培养细胞(3.3±0.8)％，(P<0.01)；MCF-7微球体细胞含有较高比例的G0/G1期(74.33±3.20)％细胞，高于MCF-7单层培养细胞(53.40±3.45)％，(P<0.01)，表阿霉素对微球体细胞与单层培养细胞的G0/G1期影响较小，但显著影响S期及G2期的比例。
结论：表阿霉素对MCF-7微球体细胞的细胞毒作用较低，并可用于富集乳腺癌干细胞，其对微球体细胞G0/G1比例影响较小。
三、乳腺间质成纤维细胞对乳腺癌干细胞的体内外调控研究
目的：体内、体外研究正常乳腺间质成纤维细胞和乳腺癌间质成纤维细胞对乳腺癌干细胞的调控作用。
方法：分离、培养正常乳腺及乳腺癌间质细胞并进行免疫组织化学鉴定。不同成纤维细胞与MCF-7微球体细胞共培养并流式细胞术分析CD44+CD24-比例。流式分选侧亚群细胞并与不同成纤维细胞接种NOD/SCID小鼠。小鼠移植瘤HE病理染色。
结果：正常间质成纤维细胞α-SMA表达阴性，而肿瘤间质成纤维细胞α-SMA表达阳性。共培养后，肿瘤间质成纤维细胞上调微球体细胞中乳腺癌干细胞的比例，[(21.4±1.8)％]Vs[(17.2±2.3)％]，P值小于0.05；正常间质成纤维下调微球体细胞中乳腺癌干细胞的比例，[(8.7±0.9)％]Vs[(17.2±2.3)％]，P值小于0.05。混合接种SP细胞和肿瘤间质成纤维细胞的小鼠均发生肿瘤，而混合接种SP细胞和正常间质成纤维细胞的小鼠仅一只发生肿瘤。
结论：肿瘤间质成纤维细胞是肌成纤维细胞，而正常间质成纤维细胞则不是。肿瘤间质成纤维细胞对乳腺癌干细胞的表达具有正向调控作用，而正常间质成纤维细胞对乳腺癌干细胞的表达具有抑制作用。肿瘤间质成纤维细胞对SP细胞的成瘤性具有正向调节作用，而正常间质成纤维细胞对SP细胞的成瘤性具有负向调节作用。
四、乳腺癌干细胞基因表达谱及基因调控网络研究
目的：通过基因芯片比较SP及MP细胞基因表达的差异，并通过网络分析的方法研究这些差异表达基因的相互作用。
方法：差异表达基因网络分析：差异表达基因KEGG Pathway分析；差异表达表因TF分析与调控网络构建及差异表达基因相互作用的网络获取与分析。
结果：SP及MP差异表达基因在细胞连接通路中表现得最为明显，出现频率高达64.71％。SP细胞中CXCR4的基因表达较MP细胞上调2.2倍。差异表达基因中，129个相互作用的基因构成了两个基因调控子网络。
结论：乳腺癌干细胞基因在细胞连接KEGG Pathway改变最为明显。乳腺癌的转移可能是乳腺癌干细胞引起的，通过CXCR4-SDF-1轴的作用。差异表达基因间的相互作用关系，构成了乳腺癌干细胞基因相互作用的调控网络。