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猪链球菌2型现有的耐药机制多局限于研究某一机制的个别基因及蛋白,难以解释细菌多重耐药产生的全部现象,更不能全面揭示细菌多重耐药的分子基础及机制。为此,我们拟采用人工诱导的方法,在实验室诱导出猪链球菌2型多重耐药菌株,在此基础上,运用蛋白组学技术,寻找耐药相关的蛋白,并通过实时荧光定量PCR的方法对实验结果进行验证。由此来探究猪链球菌在多重耐药产生过程中获得耐药性的主要方式及其共存的耐药机制。具体研究内容如下:
1猪链球菌多重耐药菌株的诱导
本文采用微量稀释法测定了临床分离的38株猪链球菌对6种抗菌药物的最小抑菌浓度(MIC)；将其中3株同时对红霉素、环丙沙星敏感的菌株采用体外递增药物浓度的方法分别诱导其对红霉素、环丙沙星同时耐药,测定亲本株与诱导株的MIC,并用外排泵抑制剂利血平联合用药探究其对猪链球菌耐药株耐药性的影响；采用PCR和基因测序的方法分析了诱导菌株的ermB、ermA、ermC、mefA、msrD、mphB、tetM、tetO、tetL、tetK、核糖体23S rRNA、核糖体蛋白L4、L22及DNA回旋酶(gyrA和gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ(parC和parE)耐药决定区(QRDR)的基因突变和氨基酸序列变化。结果表明:临床分离的猪链球菌对红霉素、环丙沙星的耐药率分别达39.5％(15/38)、28.9％(11/38),对磺胺间甲氧嘧啶及四环素均耐药,对氨苄西林、氟苯尼考均敏感；用红霉素和环丙沙星采用浓度递增法成功诱导了猪链球菌对红霉素及环丙沙星耐药；环丙沙星与利血平联合用药时,其MIC值显著降低,但红霉素与利血平联合用药时,MIC值基本没有变化；PCR及测序结果显示诱导的多药耐药菌株无外源耐药基因ermB、ermA、ermC、mefA,msrD、mphB,但检测到tetM和tetO及氟喹诺酮靶位DNA回旋酶(gyrA和gyrB)和拓扑异构酶Ⅳ(parC和parE)耐药决定区(QRDR)的突变。
2猪链球菌敏感株与诱导耐药株双向凝胶电泳试验
为了分离猪链球菌临床敏感株和诱导耐药株的差异蛋白质,筛选与猪链球菌产生多重耐药相关的蛋白质分子,进一步揭示猪链球菌产生耐药性的相关耐药机制,本实验通过Triton X-114法分别提取两种细菌的膜相关蛋白,进行等电点聚焦和SDS-聚丙烯胺凝胶电泳,对所得胶图利用ImageMaster5.0软件进行分析。在此基础上,选取差异点进行质谱分析,对分析结果进行数据库检索。通过实验得到了分辨率较好的双向凝胶电泳图谱,在敏感株与耐药株膜蛋白图谱中分别检出(311±53)和(237±53)个蛋白质斑点,初对其中的9个差异蛋白质斑点切取并进行了MALDI-TOF-MS分析。将原始质谱文件输入并查寻NCBI数据库,搜索后均匹配得到与猪链球菌相关的蛋白质点,每个蛋白质点有一到多个蛋白群组成.由此发现,在猪链球菌临床敏感株和诱导耐药株之间存在差异表达蛋白,通过对双向凝胶电泳有关条件进行优化,可将这些蛋白质斑点有效分离,己鉴定的蛋白质与细菌的新陈代谢、毒力、耐药性等有关,可为进一步研究猪链球菌多重耐药机制提供线索。
3实时荧光定量RT-PCR检测耐药相关差异蛋白的mRNA表达水平
为了进一步研究蛋白质组学实验中发现的多药耐药相关ABC转运蛋白在细菌耐药性产生过程中的作用,本文通过荧光定量PCR的方法测定了环丙沙星敏感猪链球菌菌株JR05730及其诱导的环丙沙星中介菌株JR05730-M和耐药菌株JR05730-EC中该转运蛋白对应基因SS2069mRNA的表达情况.结果表明:随着细菌耐药性的加强,中介菌和耐药菌SS20619基因mRNA的表达量分别提高了4.7和6.3倍.本研究结果进一步佐证了该ABC转运蛋白可能与细菌耐药性的产生相关。