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基因组的设计与合成打破了非生命化学物质与生命的界限,开启了生命科学研究的全新范式。病毒和原核生物基因组的人工合成开启了人类通过生命合成研究生物本质的进程。原核生物基因组一般呈环状,结构信息相对简单;而真核生物基因组一般由多条线性染色体组成,序列信息庞大,结构和功能更加复杂,人工重新设计和构建的难度远高于原核生物。“人工合成酿酒酵母基因组”(Sc2.0)国际合作计划旨在对酿酒酵母基因组的16条染色体进行重新设计与化学再造,本研究主要针对真核生物酿酒酵母V号染色体进行设计、构建、纠错与再设计。基于Sc2.0基因组设计原则,合成型V号染色体(synV,536,027 bp)在天然酿酒酵母V号染色体(wtV,576,874 bp)的基础上进行重新设计,主要包括:用合成型人工端粒替换2个亚端粒区域,删除30个转座子或Ty元件、20个tRNA基因、10个内含子,插入176个loxPsym位点,将62个TAG终止密码子更换为TAA终止密码子,利用氨基酸密码子的简并性引入339对PCRTag标签。SynV染色体长度较wt V缩减7.62%,引入核苷酸变化62,450 bp,约占wtV的10.83%,增强了V号染色体的遗传稳定性和操作柔性。在synV合成构建过程中,本研究创建了多级模块化DNA组装技术、迭代替换染色体构建方法和基于酿酒酵母减数分裂重组的并行式染色体合成方法。利用263个长约2?4 kb的DNA片段,经过19轮连续的迭代替换获得了具有完整生命活性的合成型V号染色体。通过并行构建携带部分合成型DNA序列的半合成型V号染色体,利用减数分裂过程中染色体间的交叉互换,获得了携带73.75%合成型V号染色体序列的半合成型染色体。化学合成再造过程中产生的生长缺陷是影响基因组合成的关键难题。本研究创建了基于酿酒酵母PCRTag的染色体缺陷靶点快速定位和精准修复技术,确认了synV染色体设计缺陷并通过对synV序列的再设计实现了对synV菌株生长缺陷的修复。前后两次升级synV设计信息,提升了Sc2.0基因组的设计能力。人工合成基因组的实际序列与设计序列的精确匹配对于检验人工基因组设计原则至关重要。本研究创建了基于多靶点片段共转化的基因组精确修复技术和染色体DNA大片段重复的修复技术。经过24轮修复工作,共计移除染色体重复序列35,888 bp,修正染色体核苷酸变化3,333 bp,首次实现了真核染色体人工化学合成序列与设计序列的精确匹配,得到了与天然酿酒酵母菌株具有相似生长表型和生长适应性的合成型酿酒酵母菌株,支撑与评判了Sc2.0基因组和当前真核生物基因组的设计原则,为超大基因组(GP-write)的人工重新设计、功能验证与技术改进奠定了基础。本研究在Sc2.0基因组基础上对基因组人工合成工作进行再设计与扩展,开发了定制化人工构建酿酒酵母环形染色体的方法,创建了酿酒酵母环形染色体模型。利用Sc2.0基因组中设计的特异性PCRTag标签可以实现对酿酒酵母细胞有丝分裂和减数分裂过程中染色体变化的追踪和分析,为研究基因组重排、癌症、衰老以及当前无法治疗的环形染色体疾病的发生机理和潜在治疗手段提供了新的研究思路和研究模型。