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甾体药物具有丰富的生理活性，是仅次于抗生素的第二大类药物，广泛用于风湿、肿瘤、炎症、感染和皮肤病等的治疗。微生物转化在甾体药物研发和生产中占有重要的地位，筛选优良菌株、发掘新的生物催化剂是发展甾体工业的重要课题。本研究以孕酮为模型分子，首次较为系统地进行以滇重楼内生真菌转化孕酮的研究，部分菌种首次用于甾体转化研究，并分离到4个新的孕酮转化产物，同时筛选到3株转化专一性好的菌株，对其中一株菌进行转化条件优化。本文主要进行了以下四个方面工作: 1、滇重楼内生真菌转化孕酮的菌株筛选 本研究从采集自云南省五个地区的滇重楼样品中分离到224株内生真菌，从菌落形态看，不同地区的内生真菌有较大差异。224株菌通过薄层层析筛选出孕酮转化率较高的42株菌，结合高效液相色谱分析，挑选出11株菌，包括:专一性好的菌株YNCA1266、YNCA1546和YNCA1229，产生2-3个转化产物的菌株YNCA1219、YNCA1655和YNCA1557，多样性丰富的菌株YNCA1212、YNCA1291、YNCA1569、YNCA1525和YNCA1206。 2、转化菌株的分类学研究 结合传统的形态学观察和ITS序列分析对11株筛选菌株进行分类学研究。ITS序列分析表明11株菌涵盖了7个类群，反映出分离菌株的多样性较丰富。结合形态学观察，确定了其中10个菌株的基本归属，包括:曲霉属3株，镰孢霉属和拟茎点霉属各2株，青霉属、毛霉属、拟盘多毛孢属各1株。菌株YNCA1525因ITS序列分析与已知菌株的同源率小于90％，其具体归属尚需更多实验证据。 3、孕酮转化产物分离及结构鉴定 从11株菌的孕酮转化产物中分离出22种转化产物，经化合物结构鉴定，7β，11α，15β，-三羟基孕酮、1-脱氢-7β，15β，-羟基孕酮、7β，15β，20-三羟基孕酮、15β，19-二羟基孕酮四个转化产物为新化合物。转化反应类型包括羟基化、侧链裂解、双键还原、脱氢、羰基还原、羟基氧化及Baeyer-Villiger氧化等。转化产物结构表明孕酮的C-11、C-15、C-6和C-7容易发生羟基化;脱氢反应发生在 C-1和C-2之间;边链裂解产物主要是化合物睾酮内酯、睾酮和AD。 本研究首次以拟茎点霉属、拟盘多毛孢属及曲霉属的杂色曲霉和聚多曲霉菌株转化甾体化合物。11株菌中杂色曲霉和产黄青霉菌催化孕酮的边链裂解;玫瑰拟盘多毛孢、卷枝毛霉和未鉴定出的YNCA1525菌株转化产物多样性丰富，从中发现新颖的孕酮转化产物。筛选到3株转化专一性好的菌株杂色曲霉YNCA1266、产黄青霉菌YNCA1229和稻恶苗霉YNCA1546，分别转化孕酮生成睾酮、睾酮内酯和11α，15β-二羟基孕酮。 4、YNCA1229转化孕酮为睾酮内酯的反应条件研究 建立了HPLC测定转化产物中睾酮内酯含量的方法。以睾酮内酯的转化率为指标，对菌株YNCA1229转化孕酮的条件进行优化。对10种培养基进行筛选，确定最适培养基为改良察氏培养基(％):蔗糖3;NaNO30.3;蛋白胨0.1;酵母膏0.2; MgSO4·7H2O0.05; KCl0.05; FeSO4·7H2O0.001; K2HPO40.1。通过HPLC分析追踪转化过程，发现在孕酮转化为睾酮内酯的过程中，中间产物睾酮和AD同时产生，15h开始产生睾酮内酯。转化48h睾酮内酯的含量趋于平稳，转化率达64.68％。确定最佳培养时间为48小时，最适pH为自然，最适温度为30℃，最适孕酮浓度为0.1％，转化率高于60％。 50L发酵罐中试实验中，菌株培养35小时后投料，转化25小时转化率达61.58％，随后稳定在60％-65％之间。HPLC分析表明，19h孕酮转化完全，25h中间产物转化完全。中试结果表明菌株转化稳定性良好。